丹参为常用中药,中医理论认为,丹参性味苦,微寒。归心、肝经。具有祛淤止痛、活血通经、清心除烦之功效。据统计,已应用于临床的丹参制剂达上百种,丹参的化学成分主要分为两类,脂溶性二萜醌类和水溶性酚酸类。药品的质量可控性是药品的基本属性,是药品的安全性和有效性的基础。经查阅大量文献,多种丹参制剂的质量控制方法已有报道,但其中仍有一些丹参制剂的质量控制方法为空白或只有以其中一种或两种有效成分作为质量控制指标的报道,不能全面评价药品的内在质量,还有一些质量控制方法需要进一步改进和完善。本课题选定六种丹参复方制剂心可宁胶囊、心可舒胶囊、冠心宁注射液、丹参滴注液、丹香冠心注射液、丹参粉针剂和丹参饮片,以制剂中君药丹参及其它主要味药的多指标成分作为质量控制指标,采用反相高效液相二极管阵列检测法,对药物的质量控制进行了较为系统的方法学研究。建立了同时测定心可宁胶囊、心可舒胶囊和冠心宁注射液中六种有效成分的反相高效液相色谱法;丹参滴注液和丹香注射液中五种水溶性成分的高效液相色谱法;丹参滴注液和丹参粉针剂中四种有效成分的高效液相色谱法以及丹参饮片中五种水溶性成分的高效液相色谱法。所建立的方法专属性强,灵敏度高、精密度和稳定性良好,可用于全面评价上述丹参复方制剂和丹参饮片的质量。第一部分丹参复方胶囊制剂多指标成分质量控制方法研究(一)反相高效液相色谱法同时测定心可宁胶囊中六种成分的含量目的:建立反相高效液相色谱二极管阵列检测法(RP-HPLC-DAD)同时测定心可宁胶囊中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量。为心可宁胶囊提供一种以水溶性和脂溶性两类成分同时作为质量控制指标的分析方法。方法:(1)提取方法:考察不同提取溶剂及提取时间对心可宁胶囊有效成分的提取效率,选择提取成分多,提取效率高的提取方法。(2)反相高效液相色谱条件的优化:选择合适的固定相,调整流动相,设计梯度洗脱程序及检测方法等色谱条件,以使被测组分色谱峰与其它峰完全分离。(3)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察6种被测组分色谱峰的分离度、理论塔板数、对称因子等是否符合要求。(4)制备标准曲线;进行最低检测限试验、精密度试验、稳定性试验和重复性试验。(5)加样回收率试验。(6)含量测定。结果:(1)提取方法:用75%甲醇,超声提取30 min,使各种有效成分达到最大提取效率。(2)色谱条件:采用DiamonsilTM C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇(A)-1%冰醋酸水溶液(B)为流动相进行梯度洗脱,梯度洗脱程序为:0~13 min,20%A;13~15 min,20%~52% A;15~28 min,52%A;28~33 min,52%~82%A;33~52 min,82%A(A+B=100%);后运行10 min;流速为1.0 mL/min;柱温为30℃;检测波长270 nm。(3)系统适用性试验:在此色谱条件下,被测组分与相邻组分的分离度均大于1.5,且各组分的色谱峰对称。理论塔板数按丹参素计不低于5000,按隐丹参酮计不低于10000。(4)标准曲线的制备:丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA进样量分别在219.0~3285、35.08~526.2、438.0~6570、16.68~250.2、10.05~150.8和18.65~279.8 ng范围内呈良好的线性关系,相关系数分别为0.9999、0.9999、0.9999、0.9998、0.9997和0.9999。(5)加样回收率试验:平均加样回收率分别为100.1%、100.8%、98.7%、100.5%、100.0%和101.8%,RSD分别为1.5%、0.96%、0.59%、1.2%、1.3%和0.58%(n=6)。(6)含量测定:在所建立的色谱条件下,对不同批次,不同生产厂家的心可宁胶囊中有效成分的含量进行同时测定,由外标法计算样品中有效成分的含量。结论:采用反相高效液相色谱二极管阵列检测法同时测定心可宁胶囊中丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮Ⅰ和丹参酮ⅡA的含量。该方法分析时间短、专属性好、准确度高,可用于综合评价心可宁胶囊的质量。(二)反相高效液相色谱法测定心可舒胶囊中六种成分的含量目的:建立了反相高效液相色谱法测定心可舒胶囊中的6种有效成分——丹参素、原儿茶醛、葛根素、丹酚酸B、隐丹参酮和丹参酮ⅡA。方法:采用DiamonsilTM C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-1%冰醋酸水溶液为流动相,进行梯度洗脱,流速1.0 mL/min,柱温30℃,检测波长270 nm。结果:在上述色谱条件下,6种成分可完全分离。丹参素、原儿茶醛、葛根素、丹酚酸B、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的进样量分别在219.0~3285 ng,14.03~210.5 ng , 114.0~1710 ng , 438.0~6570 ng , 10.42~156.4 ng ,9.325~139.9 ng范围内线性关系良好,相关系数分别为0.9999、0.9999、0.9999、0.9996、0.9997和0.9997。平均回收率分别为100.4%、99.5%、98.0%、98.6%、101.7%和100.9%,RSD分别为1.6%、1.8%、0.80%、0.79 %、0.64%和1.5%(n=6)。结论:采用高效液相色谱二极管阵列检测法可同时测定心可舒胶囊中丹参素、原儿茶醛、葛根素、丹酚酸B、隐丹参酮和丹参酮ⅡA的含量,该方法具有分析时间短,线性范围宽,专属性强,准确度高等优点,可用于综合评价心可舒胶囊的质量。第二部分丹参复方注射剂类药物多指标成分质量控制方法研究(一)高效液相色谱-二极管阵列检测法测定冠心宁注射液中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸和丹酚酸B目的:建立高效液相色谱-二极管阵列检测法同时测定冠心宁注射液中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸和丹酚酸B 6种水溶性成分的含量。方法:采用DiamonsilTM C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-5%冰醋酸,进行梯度洗脱;体积流量1.0 mL/min;进样体积20μL;柱温30℃,检测波长286 nm。结果:在此色谱条件下,6种水溶性成分可完全分离。丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸和丹酚酸B的线性范围分别为87.68~438.40 ng(r=0.9993),29.68~148.40 ng(r=0.9997),14.03~70.16 ng(r=1.0000),30.40~152.00 ng(r=0.9999),103.70~518.40 ng(r=0.9996),193.20~966.00 ng(r=0.9996)。平均回收率丹参素为98.2%(RSD=0.27%),原儿茶酸为98.4%(RSD=1.2%),原儿茶醛为99.2%(RSD=1.3%),阿魏酸为98.9%(RSD=0.96%),迷迭香酸为98.1%(RSD=0.82%),丹酚酸B为99.3%(RSD=0.31%)。结论:采用反相高效液相色谱法可同时测定冠心宁注射液中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、阿魏酸、迷迭香酸和丹酚酸B的含量。该方法简单、准确、重现性好,可用于冠心宁注射液的质量控制。(二)反相高效液相色谱二极管阵列检测法同时测定丹参类注射液中5种水溶性成分的含量目的:建立反相高效液相色谱-二极管阵列检测法同时测定丹参类注射液中5种水溶性成分丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的含量。方法:采用DiamonsilTM C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-5%冰醋酸为流动相,进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温30℃,检测波长298 nm。结果:在此色谱条件下5种水溶性成分可完全分离。丹参素、原儿茶酸、原儿茶酸、迷迭香酸和丹酚酸B的线性范围分别为0.5480~3.836μg(r=0.9992),0.01484~0.1039μg(r=1.0000),0.01052~0.07367μg(r=1.0000),0.04536~0.3175μg(r=0.9999),0.1546~1.082μg(r=1.0000)。平均回收率丹参素为101.2%(RSD=2.3%),原儿茶酸为97.8%(RSD=0.16%),原儿茶醛为102.4%(RSD=0.83%),迷迭香酸为101.6%(RSD=1.2%),丹酚酸B为102.5%(RSD=0.26%)。结论:采用反相高效液相色谱法,同时测定丹参类注射液中丹参素、原儿茶酸、原儿茶酸、迷迭香酸和丹酚酸B的含量。该法分析时间短,柱效高,重现性好,为丹参类注射液的综合质量控制提供了简单、准确的分析方法。(三)高效液相色谱二极管阵列检测法同时测定丹参滴注液中四种水溶性成分的含量目的:建立了反相高效液相色谱-二极管阵列检测(RP-HPLC-DAD)法同时测定丹参滴注液中丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B四种水溶性成分的含量。方法:采用DiamonsilTM C18色谱柱(250×4.6 mm,5μm),以甲醇和5%冰乙酸为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温30℃,检测波长为286 nm。结果:在此色谱条件下四种水溶性成分可完全分离。丹参素、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的线性范围分别为0.2192~1.934μg(r=0.9999),0.0351~0.2456μg(r=1.0000),0.2592~1.814μg(r=1.0000),0.3864~2.705μg(r=0.9999)。平均回收率丹参素为102.6%,相对标准偏差(RSD)为0.55%;原儿茶醛为103.5%,RSD为0.42%;迷迭香酸为99.8%,RSD为0.68%;丹酚酸B为102.8%,RSD为0.49%。结论:该方法简单、快速,四组分分离良好,可用于丹参滴注液的质量控制。(四)反相高效液相色谱二极管阵列检测法同时测定丹参粉针剂中4种水溶性成分的含量目的:建立反相高效液相色谱-二极管阵列检测法(RP-HPLC-DAD)同时测定丹参粉针剂中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、迷迭香酸4种水溶性成分的含量。方法:采用DiamonsilTM C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇-5%冰醋酸为流动相,进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温30℃,检测波长为298 nm。结果:在此色谱条件下,4种水溶性成分完全分离。丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛和迷迭香酸的线性范围分别为0.1644~2.630μg(r=0.9999),0.007420~0.1187μg(r=1.0000),0.008770~0.1403μg(r=1.0000),0.01944~0.3110μg(r=1.0000)。平均回收率丹参素为101.6%(RSD=1.1%),原儿茶酸为102.2%(RSD=1.8%),原儿茶醛为101.3%(RSD=2.0%),迷迭香酸为100.9%(RSD=1.6%)结论:采用反相高效液相色潽-二极管阵列检测法测定丹参粉针剂中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛和迷迭香酸的含量。该方法简单、快速,4组分分离良好,可用于丹参粉针剂的质量控制。第三部分反相高效液相色谱二极管阵列检测法同时测定丹参饮片中5种水溶性成分的含量目的:建立反相高效液相色谱-二极管阵列检测法(RP-HPLC-DAD)同时测定丹参饮片中5种水溶性成分丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的含量。方法:采用DiamonsilTM C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5μm),以甲醇和5%(v/v)冰醋酸为流动相进行梯度洗脱,流速为1.0 mL/min,柱温30℃,检测波长为298 nm。结果:在此色谱条件下5种水溶性成分可完全分离。丹参素、原儿茶酸、原儿茶酸、迷迭香酸和丹酚酸B的线性范围分别为0.5480~3.836μg(r=0.9992),0.0148~0.1039μg(r=0.9999),0.0105~0.07367μg(r=0.9999),0.0454~0.3175μg(r=0.9999),0.1546~1.082μg(r=0.9999)。平均回收率丹参素为100.7%(RSD=0.96%),原儿茶酸为100.8%(RSD=1.0%),原儿茶醛为100.6%(RSD=0.60%),迷迭香酸为100.7 %(RSD=1.0%),丹酚酸B为101.3%(RSD=0.88%)。结论:采用反相高效液相色潽法同时测定丹参饮片中丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的含量。为丹参药材的质量综合评价和控制提供了简单、准确、可行的分析方法。