蛋白质的展开和折叠是实现生物蛋白特异性功能的基础物理化学过程,其中偶然发生的错误折叠常常导致蛋白质的变性和淀粉样纤维化,从而诱发诸如帕金森病或阿尔茨海默氏病等严重的神经退行性疾病。当前,关于蛋白质错误折叠的研究主要着重于淀粉样生长的宏观特性(主要是形貌变化等),而对于蛋白质变性聚集过程(尤其是成核过程)的分子尺度观测和研究则寥寥无几。因此,尽管已有很多文献讨论蛋白质纤维化的微观机制,但由于缺乏直接的光谱和动力学证据,目前对于淀粉样蛋白形成的确切机理没有统一定论,尤其缺少对低聚物或纤维分子微观结构的细节描述。准确认知蛋白质展开或折叠过程中分子二级和三级结构的变化,以及分子微环境的改变对理解蛋白质变性机制起着至关重要的作用。本文中,我们采用溶菌酶分子作为代表,通过振动分辨的Raman光谱测量,深入研究了其热变性、化学变性以及淀粉样纤维化过程中分子二级和三级结构的变化。我们分别采用了对二级结构变化敏感的S-S伸缩振动,N-Cα-C键以及酰胺Ⅰ振动带作为光谱指针,研究了溶菌酶分子变性过程中的结构变化,特别是在纤维化过程中α螺旋和β片层结构的相对布居比。此外,通过对氨基酸侧链残基色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸以及C-H键振动光谱的定性和定量分析了解这些氨基酸侧链分子相互作用以及微环境的变化,从而认知相应溶菌酶蛋白的三级结构变化。(1)溶菌酶的热变性以及化学变性在加热或盐酸胍作用下,鸡蛋清溶菌酶会发生典型的热变性或化学变性过程,然而迄今其变性机制仍存在“一阶段模型(single-stage)”和“多阶段模型(multi-stage)”的争议。本文中,我们应用了拉曼光谱分别研究了溶菌酶的热变性和化学变性过程。随着温度的升高和热孵化时间的延长,光谱显示氨基酸侧链基团的拉曼谱峰先于主链基团发生改变,这直接证实了溶菌酶分子热变性的二阶段机制,其中间状态-熔球状中间体具有完整的二级结构和松散的三级结构。此外,三级结构展开的特征温度约为74℃,,而在76.5℃左右发生二级结构的改变。溶菌酶的化学变性也具有类似热变性过程的变化规律,三级结构在盐酸胍质量百分比浓度为31%的时候逐渐展开,而二级结构则在盐酸胍浓度增加至32.5%的时候迅速改变。此外,溶菌酶侧链和主链基团振动谱峰的依次改变也证实了盐酸脈变性剂的“outside-in”机理,即盐酸胍优先影响分布在蛋白质表面的基团,随后才逐渐影响位于疏水核心内部的分子基团。相比于热变性过程,溶菌酶的化学变性更加突出地表现出多步骤由外向内的机制,存在包含熔球状中间体在内的多个中间状态。总而言之,我们的拉曼光谱研究不仅在分子水平上给出了溶菌酶变性过程多态机制的直接实验证据,而且更为清晰地显示出溶菌酶蛋白变性中三级和二级结构依次变化的特征温度与动力学浓度。(2)溶菌酶的纤维化蛋白质纤维化是神经退行性疾病发生的标志,伴随形成的是一个垂直于纤维轴的有序β片层结构,这一构象变化被普遍认为与蛋白质致病性以及毒性有关。然而,至今关于蛋白质纤维化过程中分子层次的微观结构及其动力学机制依然没有得到细致的阐述。本研究主要利用拉曼光谱追踪热酸(pH 2.0,65℃)条件下的溶菌酶淀粉纤维化过程。我们采用了三个拉曼光谱指针N-Cα-C(933cm-1),酰胺Ⅰ(1650cm-1)以及色氨酸Fermi共振强度比(I1340/I1360),追踪纤维化过程中α螺旋结构、β片层结构以及三级结构的改变。结合它们的谱峰位置以及强度比例变化,我们得到了蛋白质结构随孵育时间变化的定量曲线,同时,联合多种技术手段(ThT荧光实验以及原子力显微镜)观测得到了溶菌酶的四步骤纤维化机制:在初始阶段(0-10小时),一旦自然态蛋白质在酸溶液中加热,它的球状三维结构立即展开,并且α螺旋结构、β片层以及卷曲结构发生重排。α螺旋结构逐渐变成无序的卷曲结构,但是此时没有形成新的β片层。由于展开作用,氨基酸残基的侧链(如Trp)逐渐暴露于亲水环境中。在这个阶段,溶菌酶开始聚集,但尺寸太小,不容易被AFM观察到。在第二阶段(10-40小时)中,α螺旋继续展开,Trp残基更加暴露在亲水环境中,直到40小时,两者不再发生变化。此时分子间β片层依然没有形成,但溶菌酶形成了类似于球状的低聚物。在第三阶段(40-90小时),分子间β片层开始形成,此时卷曲结构开始大量转化成分子间β片层结构。溶菌酶开始生长成没有分叉的原纤维,直径为6-12纳米。在成熟的阶段(90-160小时),原纤维逐渐组装成成熟的纤维样,直到160小时达到饱和。除此之外,金属离子Al(Ⅲ)离子在蛋白质纤维化过程中同样也被认为扮演了重要的角色。然而,在淀粉样纤维蛋白的形成过程中,Al(Ⅲ)离子对纤维化过程究竟是促进作用还是抑制作用以及其毒性的讨论仍然存在较多争论。我们主要利用拉曼光谱技术结合AFM、荧光光谱等技术手段同步检测了 Al(Ⅲ)/热孵育下的溶菌酶淀粉纤维化过程。在Al(Ⅲ)/热条件下的早期孵化阶段,Trp双峰的强度比I1340/I1360逐渐增加,表明更多的Trp吲哚环暴露在水里,暗示了溶菌酶三级结构的展开。同时,透过率的测量表明Al(Ⅲ)离子在早期更有利于凝胶样的形成。大约几个小时后,在933 cm-1波数处,N-Cα-C伸缩振动的蓝移表明了溶菌酶的α螺旋二级结构的破坏。几乎同时,也发现了酰胺Ⅰ(1620-1700 cm-1)和酰胺Ⅲ(1220-1300 cm-1)拉曼频率的蓝移。因此,在Al(Ⅲ)/热孵育下溶菌酶形成了富含大量分子间β片层结构的成熟淀粉样纤维。有趣的是,在Al(Ⅲ)/热以及热酸孵化条件下,两种成熟纤维样的形态和光谱特征几乎相同。然而,通过比较两种环境下纤维化的相关动力学,我们得到了 Al(Ⅲ)离子对溶菌酶淀粉样纤维形成的矛盾作用:相比于酸性条件,在初始阶段,Al(Ⅲ)离子通过配位肽链的羰基氧原子从而延迟了对α螺旋的破坏作用,这导致凝胶化过程相对纤维化过程更为突出;然而,其离子静电能又通过吸引周围肽链骨架的N-H基团而加快形成了分子间β片层的氢键网络,从而促进了 α螺旋到分子间β片层的转变。(3)拉曼光谱预测蛋白质结构含量能够快速准确地获得蛋白质的二级结构含量对于理解蛋白质的结构与功能非常重要。我们的拉曼光谱研究给出了一种简单而快速的方法,以酰胺Ⅰ(1600-1700cm-1)的拉曼位移作为参数,获得了近13种蛋白质的酰胺Ⅰ拉曼频率和α螺旋、β片层以及卷曲结构(从x射线中衍生出的含量数据)的比例关系。结果显示,α螺旋和β片层的含量与酰胺Ⅰ的拉曼位移呈线性关系,它们之间具体的关系式如下:v(max)= 1680.3-0.25 ×(α-helix%)v(max)= 1663.9 + 0.38×(β-sheet%)它们的相关系数达到0.88,而卷曲结构由于与a螺旋以及b片层都重叠较为严重,因此线性关系较差。得出的这两个关系式也被用于预测了其他纯净物或者混合物的结构含量,结果显示具有一定的可信度。