论文部分内容阅读
目的：研究表明药物涂层支架术后再狭窄的形成主要表现为内膜增生和血管重塑,而血管平滑肌细胞(VSMCs)的过度增殖在其中起到了重要作用。本研究旨在通过构建SM22alpha-p27-EGFP重组慢病毒载体,探讨SM22alpha启动子对VSMCs p27蛋白过表达及特异性选择作用,选择重组慢病毒感染细胞最适宜MOI,为慢病毒调控细胞周期机制研究提供进一步依据。方法：鼠尾基因组钓取sm22alpha,构建携带p27基因的慢病毒和无p27基因的对照空病毒。感染原代培养平滑肌细胞和内皮细胞,流式细胞术确定病毒的选择性感染能力及感染复数；免疫荧光法和Western Blot检测p27基因在两种细胞中的表达及细胞形态变化。结果:1)从大鼠基因组中提取SM22alpha启动子,构建SM22alpha-p27-EGFP及SM22alpha-null-EGFP重组慢病毒,病毒滴度为5×108U/ml。2)FACs示SM22alpha启动子具有平滑肌细胞特异性选择作用,选定最适MOI为103)免疫荧光染色示SM22alpha promoter-p27-EGFP病毒能够有效过表达p27蛋白4)Western Blot提示p27蛋白过表达且证实存在重组蛋白。结论：SM22alpha启动子介导的重组慢病毒载体具有平滑肌特异性选择作用且能够有效过量表达p27蛋白。目的：第一部分的研究表明,重组慢病毒SM22alpha-p27-EGFP能够选择性感染平滑肌细胞并过表达p27蛋白。本部分研究同紫杉醇相比,重组慢病毒是否能够通过p27的过表达有效达成细胞周期阻滞、抑制细胞增殖的作用。探讨重组慢病毒和紫杉醇对细胞周期调控机制,为临床DES改进提供新的思路。方法：BrdU染色分析紫杉醇与重组慢病毒对血管平滑肌细和血管内皮细胞增殖能力的影响。采用流式细胞术检测正常培养和不同药物干预组血管内皮细胞和血管平滑肌细胞细胞周期分布。结果：BrdU结果示平滑肌细胞组中：紫杉醇与SM22alpha-p27过表达病毒均能够有效抑制vsmc增殖(p<0.05),其中紫杉醇与过表达病毒对于vsmc增殖的抑制更加明显(p<0.01)；内皮细胞组,紫杉醇能够有效抑制vsmc增殖(p<0.05),但阴性对照病毒及过表达病毒抑制增殖能力并没有统计学意义。流式结果示紫杉醇干预后的内皮细胞和平滑肌细胞均表现出G2/M期阻滞现象,伴随S期分布减少,G0/G1期细胞分布减少(p<0.05)；SM22alpha-p27重组慢病毒特异性的对平滑肌细胞产生G1/S期阻滞,G0/G1期分布增加(p<0.05),S期细胞分布显著减少(p<0.01)。结论：同紫杉醇广泛的抑制细胞增殖相比,SM22alpha-p27-EGFP重组慢病毒能够高效、特异性的抑制平滑肌细胞增殖,且能够阻滞细胞周期G1/S期终止细胞周期进展。