论文部分内容阅读
基因组解偶联基因4(GENOMES UNCOUPLED4, GUN4)最先在拟南芥中发现,不仅通过激活镁螯合酶活性从而促进叶绿素合成,而且可能参与质体→核反向信号途径的调控,但其具体机理尚不清楚。本研究中,我们以一个水稻叶绿素缺陷型的黄叶突变体黄玉B(HYB)为材料,利用图位克隆,鉴定到一个GUN4的水稻同源基因OsGUN4,并确定该黄叶特征是由一个表观遗传突变等位基因epi-GUN4所控制。HYB的核苷酸序列与野生型亲本的完全一致,但在其启动子中的一个抗氧化应答元件(antioxidant response element, ARE)的甲基化水平增加；去甲基化处理可部分恢复epi-GUN4的功能,使黄叶型幼苗回复正常绿色。在此基础上,我们确定了OsGUN4的亚细胞定位,分析了OsGUN4对弱强光转换和H2O2胁迫下的响应途径。主要结果如下：HYB具有光照强度敏感性。田间条件下,HYB在整个发育期内表现稳定的黄叶表型,其叶绿素含量仅为野生型亲本龙特浦B (LTB)的15.0%。该突变表型对环境条件敏感,特别是光照强度。在弱光条件下,HYB植株表现淡绿叶色,叶绿素含量约为LTB植株的33%；经强光下培养10天后,突变体叶色呈现黄色,其叶绿素含量仅为LTB植株的5%。OsGUN4是HYB黄叶突变性状的候选基因。为了揭示控制黄叶突变性状的分子机理,采用图位克隆法,利用来自于HYB和其他3个野生型(wild-type)品种杂交所构建的3173个F2黄叶隐性单株个体,在先前定位的基础上,进一步将该黄叶突变位点(xantha, XNT)定位于第11号染色体短臂上约57kb区间内,位于分子标记IDS7和SNP18之间。该区段共有8个预测的开放编码阅读框(open reading frames, ORFs),其中ORF2(Osllg1267000)预测编码OsGUN4蛋白。但是,对定位区段的测序结果表明,HYB与LTB之间的核苷酸序列并无差异。为此,进一步对8个ORFs做了qRT-PCR表达分析。尽管ORF2在LTB植株叶片中高度表达,但在HYB突变体植株中几乎检测不到OsGUN4转录物,而其他7个ORFs的表达则在LTB与HYB之间无显著差异。HYB的黄叶突变位点是OsGUN4基因的等位突变位点。为了证实可能是OsGUN4基因的突变导致了黄叶表型,将HYB与经伽玛射线诱变处理的一个温敏雄性不育水稻GS113的M2群体杂交,从约30000个M3FI穗行中选育得到4个出现黄叶幼苗的穗行。为了确定这些黄苗是否由OsGUN4基因突变引起,对该位点进行了测序,发现黄叶幼苗存在3种缺失突变(其中2个穗行的突变一致),并定名为gun4-1～gun4-3。这些结果表明,HYB的黄叶突变是OsGUN4基因的等位突变位点。黄叶突变是由OsGUN4的表观遗传突变引起。利用硫化测序法对HYB突变体中OsGUN4基因及其上下游序列进行了甲基化分析,发现OsGUN4的启动子区域-2386bp处有一个甲基化发生变化的位点,并且该位点恰好处于抗氧化应答元件(antioxidant response element, ARE)上。利用去甲基化试剂5-氮嘧啶-2’杂(5-aza-2’-deoxycytidine,5-aza-dC)处理HYB及其黄叶衍生系会有28.0-56.0%的幼苗叶色恢复正常绿色,从而进一步确定了HYB的黄叶突变是一个OsGUN4的表观遗传等位突变,记为epi-GUN4。OsGUN4的表达受ROS的间接诱导。OsGUN4基因仅含一个外显子,cDNA全长1071bp,编码273个氨基酸,具有143个氨基酸(第87-229个)组成的GUN4蛋白特有的类GUN4结构域。利用除草剂氟草敏(Norflurazon, NF)处理幼苗后,LTB中与光合作用活性相关的基因LHCB、PsaA的表达水平显著降低,而HYB中LHCB、PsaA仍可维持较高的表达水平,表明epi-GUN4具有基因组解偶联(Genomes Uncoupled, GUN)类基因所具有的典型特征,即其突变或下调表达并不会导致光合作用相关基因表达的下降。此外,H202和强光处理后,LTB中OsGUN4的表达量均有显著上升,而HYB中则保持不变,可见ARE元件是ROS诱导OsGUN4表达所必需的。放线菌酮(Cycloheximide, CHX)、放线菌酮和H202共处理LTB幼苗后,OsGUN4的相对表达量均远远低于H202单独处理时的表达量,并且二者OsGUN4的表达具有类似的变化趋势,表明OsGUN4的表达受ROS的间接诱导。利用亚细胞定位的方法确定了水稻GUN4蛋白是一个定位于叶绿体的蛋白。在恒光恒温(16h850μmol m-2s-1/8h暗培养,30℃)条件下,采用qRT-PCR方法分析表明,OsGUN4在粳稻品种日本晴和籼稻品种LTB中的表达具有光周期节律性。OsGUN4突变会反馈影响许多核基因的表达。弱光下HYB植株合成的叶绿素几乎与LTB相仿,表明水稻GUN4蛋白并非叶绿素合成所必需的,但其在ROS诱导的质体→核反向信号调控的抗氧化基因表达中可能起着重要作用。强光和H202的胁迫可激活Nrf2-ARE/Keap1抗氧化系统的应答,而在HYB中该系统未被充分激活。我们也证实Nrf2和Keapl的表达受ROS的间接诱导。此外,还分析了OsGUN4突变对抗氧化基因表达影响,发现HYB突变体中NodL、OCT3、 BAP1、OCT3、FER2和WRKY等基因的表达变化(下降)较大,TRFL4、APX1相对较小,而DREB2A则基本不变。为阐述OsGUN4在质体→核反向信号途径中的作用,我们提出了一个初步的假说。综上所述,OsGUN4启动子区域的ARE元件不仅是OsGUN4正常表达所必需的,而且对于OsGUN4在氧化胁迫应答中发挥正常功能是重要的。水稻GUN4蛋白可能发挥多种功能,在强光胁迫下可能主要参与清除来自于O2分解而产生的ROS,而弱光下则促进叶绿素的合成。此外,HYB也是一个水稻中具有独特特性的表观遗传突变体,主要表现为：(1)HYB中DNA甲基化位点恰好位于OsGUN4基因的启动子区域ARE元件上,表明ARE元件的甲基化抑制了OsGUN4基因的表达：(2)HYB中,OsGUN4临近的上下游基因均有正常的表达,因此甲基化标记仅影响OsGUN4基因的表达；(3)HYB的表观遗传表型很稳定,可经多代选择,因可作为一个快速筛选标记用于水稻育种生产中。总之,epi-GUN4是一个独特的水稻表观遗传突变位点,为揭示包括ARE在内的调控元件的甲基化变化所引发的调控功能提供了有利条件。