背景心肌细胞缺氧可促进细胞膜脂质过氧化反应,促进活性氧自由基的生成,引发心肌细胞损伤,并伴随细胞中电解质的改变以及细胞体积和细胞膜磷脂层组分的变化,进而影响心肌细胞功能,近来研究发现,葛根素对多种细胞具有保护作用,可能通过激活PI3K/AKT和AMPK通路实现保护作用,研究发现,PI3K/AKT以及AMPK信号通路的激活可能依赖于细胞中Sirt1的表达量变化,而目前对葛根素调控PI3K./AKT和AMPK信号通路中Sirt1的作用尚无明确的研究,特别在葛根素对低氧诱导心肌细胞损伤过程中的保护作用尚缺乏研究报道。目的通过低氧诱导心肌细胞体外损伤实验,探究葛根素预处理对心肌细胞的保护作用,并从磷酸肌醇3激酶(phosphotylinosital 3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,PKA/AKT)和腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine monophosphate activated protein,AMPK)通路出发,深入研究葛根素抑制细胞凋亡和促进细胞活力潜在的作用机理,此外,在此基础上深入分析了葛根素对抗凋亡蛋白(Bcl-2)和促凋亡蛋白(Cleaved/Pro-Caspase-9 和 Cleaved/Pro-Caspase-3)在蛋白水平表达量的调控作用,进一步从Sirt1角度出发,探究低氧诱导对Sirt1的调控作用,研究葛根素预处理对低氧诱导心肌细胞中Sirt1的调控作用,以及对细胞活力和凋亡的影响,以PI3K/AKT和AMPK通路为主要研究对象,探究葛根素预处理对低氧诱导心肌细胞中PI3K/AKT和AMPK通路的激活情况,以及Sirt1在通路激活过程中所发挥的作用,本实验旨在为探究葛根素抑制心肌细胞低氧损伤的作用机理,以期为葛根素应用于改善低氧诱导心肌细胞损伤提供一定的实验依据。方法(1)第一部分:葛根素抑制低氧诱导造成的H9c2心肌细胞损伤。以大鼠胚胎心肌细胞为实验细胞来源,并通过低氧诱导心肌细胞损伤建立细胞损伤实验模型,期间以细胞活力为主要指标,确定了低氧诱导心肌细胞损伤的作用时间,并确定了该低氧诱导方式对细胞凋亡率和凋亡相关因子表达量的影响作用;在探究葛根素预处理对H9c2心肌细胞保护作用的过程中,首先用浓度为0、20、40、60、80和100 μM的葛根素预处理心肌细胞,以细胞活力为主要指标,明确葛根素对H9c2心肌细胞的毒性作用,最终确定了葛根素预处理浓度为60 μM;浓度为60 μM的葛根素预处理细胞后低氧诱导心肌细胞损伤,以探究葛根素预处理对心肌细胞低氧诱导损伤的抑制作用,并进一步探究了其对凋亡相关因子 Bcl-2、Pro-Caspase-9、Pro-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9 和Cleaved-Caspase-3在蛋白水平表达量的影响,此外还深入研究了低氧诱导损伤对PI3K/AKT信号通路中PI3K和AKT磷酸化水平的影响,以及AMPK信号通路中AMPK磷酸化的影响作用。在本部分的实验过程中,采用细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8,CCK-8)方法测定细胞活力,采用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-Fluorescein isothiocyannate/Propidium iodide,Annex V-FITC/PI)凋亡测定试剂盒测定细胞凋亡情况,并采用Western blot方法测定凋亡相关因子 Bcl-2、Pro-Caspase-9、Pro-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9和Cleaved-Caspase-3在蛋白水平的表达量,PI3K/AKT信号通路和AMPK信号通路中PI3K、AKT和AMPK的磷酸化水平同样采用Western blot方法测定。(2)第二部分:葛根素调控Sirt1降低心肌细胞损伤。在第一部分的研究基础上,本部分进一步探究了葛根素预处理对低氧诱导心肌细胞损伤过程中Sirt1的调控作用。并通过采用si-Sirt1沉默H9c2细胞中Sirt1的表达验证其在葛根素调控细胞活力和凋亡过程中的作用,实验过程中验证了 si-Sirt1对H9c2心肌细胞中Sirt1在蛋白水平上表达量的下调作用,我们还探究了沉默Sirt1在葛根素抑制细胞凋亡过程中所发挥的作用,主要以凋亡相关因子Bcl-2、Pro-Caspase-9、Pro-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9 和 Cleaved-Caspase-3 在蛋白水平上的表达量为指标。在本部分的实验过程中,Sirt1在mRNA水平上的表达量采用实时定量PCR的方法测定,Sirt1在蛋白水平上的表达量采用Western blot的方法分析,Bcl-2、Pro-Caspase-9、Pro-Caspase-3、Cleaved-Caspase-9 和Cleaved-Caspase-3在蛋白水平上的表达量同样采用Western blot的方法测定。(3)第三部分:葛根素通过介导Sirt1参与调控PI3K/AKT和AMPK通路。在本部分的实验研究中,我们进一步探究了葛根素预处理对PI3K/AKT信号通路以及AMPK通路调控过程中Sirt1所发挥的作用。在本部分的实验中,我们采用浓度为60 μM的葛根素预处理心肌细胞48 h后,沉默细胞中si-Sirt1的表达,并低氧诱导心肌细胞损伤,随后采用Western blot的方法测定PI3K/AKT和 AMPK通路中相关蛋白(PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、AMPK和p-AMPK)的表达量,明确葛根素预处理对PI3K、AKT和AMPK磷酸化水平的影响,进而探究葛根素对PI3K/AKT和AMPK通路的激活作用,以及验证葛根素通过介导Sirt1参与调控PI3K/AKT通路和AMPK信号通路。此外,利用PI3K/AKT和AMPK通路抑制剂和激活剂作用细胞,验证葛根素是通过调控Sirt1表达作用PI3K/AKT和AMPK通路,并最终保护H9c2细胞免受缺氧损伤。结果(1)第一部分:葛根素抑制低氧诱导造成的H9c2心肌细胞损伤。对H9c2心肌细胞进行低氧处理,低氧处理时间分别为0、12、24和48 h,CCK-8实验结果表明,同Control组相比,低氧处理24h后,H9c2细胞活力显著降低(P<0.05),细胞活力降低至50%,低氧处理48 h后,H9c2细胞活力低于50%(P<0.001),在我们探究的低氧处理时间范围内,H9c2细胞活力同作用时间呈负相关,后续实验研究选用低氧诱导作用时间为24 h。细胞凋亡结果表明,同Control组相比,H9c2细胞经低氧诱导24h后,其凋亡率显著上升(P<0.001)。Western blot结果表明,同Control组相比,低氧诱导24h后,低氧诱导能够降低细胞抗凋亡因子Bcl-2的表达量,进一步分析低氧诱导对促凋亡因子的影响,我们发现,低氧诱导损伤24 h后,同Control组相比,低氧损伤组的Cleaved/Pro-Caspase-9值明显高于Control组,除此之外,Caspase-3也呈现相似的规律。用不同浓度(0、20、40、60、80和100 μM)的葛根素处理H9c2细胞48 h后,细胞活力结果表明,同Control组相比,葛根素作用浓度为80 μM和100μM时,显著降低了细胞活力(P<0.05),对细胞表现毒性作用,然而,葛根素浓度在20-60μM范围内时,对细胞活力无明显的抑制或促进作用,因此,后续实验选用的葛根素浓度为60 μM。葛根素对低氧诱导细胞损伤的预保护作用结果表明,同Control组相比,低氧处理H9c2细胞显著降低了其细胞活力(P<0.01),同Hypoxia组相比,H9c2细胞经60 μM葛根素预先处理48 h后,其细胞活力显著高于Hypoxia组,葛根素预处理H9c2细胞能够改善低氧造成细胞活力降低的现象,结果发现,同Control组相比,低氧处理能够显著提高凋亡细胞所占的比例(P<0.001),而同Hypoxia组相比,H9c2细胞经60μM葛根素预先处理48 h后,然后低氧诱导损伤,其细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。Western blot结果表明,同低氧诱导损伤组相比,预先经葛根素保护后诱导损伤的细胞中,抗凋亡因子Bcl-2的表达量发生上调(P<0.05),且能够抑制促凋亡因子活性形式Cleaved-Caspase-9/3的生成(P<0.01)。对PI3K/AKT和AMPK信号通路的研究结果表明,同Hypoxia相比,H9c2细胞经60μM葛根素预处理后,细胞中p-PI3K和p-AKT所占比例显著上升(P<0.05),说明低氧诱导损伤能够抑制PI3K/AKT信号通路的激活,而葛根素预处理细胞能够改善低氧诱导对PI3K/AKT信号通路产生的抑制作用;同Hypoxia组相比,H9c2细胞经60μM葛根素预处理后,p-AMPK和AMPK的比值明显增加(P<0.001),促进了 AMPK的磷酸化。(2)第二部分:葛根素调控Sirt1降低心肌细胞损伤。qRT-PCR结果表明,同Control组相比,低氧诱导损伤显著降低了 Sirt1在mRNA水平上的表达量(P<0.05),同Hypoxia组相比,H9c2细胞经葛根素预处理后,低氧诱导损伤显著上调了 Sirt1的表达量(P<0.001);Western blot结果表明,对Sirt1在蛋白质水平的相对表达量分析发现,同Control组相比,低氧诱导显著降低了 H9c2细胞中Sirt1在蛋白水平上的表达量(P<0.05),H9c2细胞经葛根素预处理后,然后低氧诱导损伤,发现同Hypoxia组相比,Sirt1在蛋白水平上的表达量发生明显上调(P<0.01);通过对H9c2细胞转染si-Sirt1来抑制Sirt1在蛋白质水平上的相对表达量,Western blot结果表明,同Control组和si-NC组相比,转染si-Sirt1后能够显著降低H9c2细胞中Sirt1在蛋白水平上的相对表达量(P<0.01),通过抑制葛根素预处理组中Sirt1的表达发现,同阴性对照组相比,其细胞活力发生显著降低(P<0.05);对细胞凋亡率的影响研究发现,通过抑制葛根素预处理组中Sirt1的表达,同阴性对照组相比,H9c2细胞凋亡率明显升高(P<0.01),对凋亡相关因子在蛋白水平的相对表达量分析发现,抑制Sirt1的表达明显降低了抗凋亡蛋白的表达量(P<0.05),促进了具有活性的促凋亡因子Cleaved-Caspase-9在Pro-Caspase-9中所占的比例(P<0.01),同样地,也促进了具有活性的促凋亡因子Cleaved-Caspase-3在Pro-Caspase-3中所占的比例(P<0.05)。(3)第三部分:葛根素通过介导Sirt1参与调控PI3K/AKT和AMPK通路。为进一步探究葛根素能否通过介导Sirt1参与调控PI3K/AKT通路,从我们的实验结果中发现,同阴性对照组相比,抑制Sirt1的表达能够明显降低葛根素预处理对PI3K的磷酸化作用(P<0.001);从对AKT磷酸化的影响作用来看,同阴性对照组相比,AKT的磷酸化比例明显上升(P<0.001);同阴性对照组相比,抑制Sirt1的表达明显降低了 AMPK的磷酸化(P<0.001)。PI3K/AKT和AMPK通路抑制剂LY294002和Dorsomorphin显著降低了细胞活力(P<0.05)、促进了细胞调亡(P<0.01)并参与调解了调亡相关蛋白的表达(P<0.01或P<0.001)。相反,PI3K/AKT和AMPK通路激活剂IGF-1和A-769662促进了细胞活力(P<0.001)、抑制了细胞调亡(P<0.01),并且对调亡蛋白的表达影响与抑制剂作用相反(P<0.01或P<0.001)。结论在探究葛根素介导Sirt1调控PI3K/AKT和AMPK信号通路以改善H9c2心肌细胞的缺氧损伤研究中,葛根素在通过调控PI3K/AKT和AMPK信号通路发挥心肌细胞保护作用,在本研究中,我们验证了 Sirt1在葛根素调控细胞损伤中的作用,主要得到以下结论:(1)葛根素预处理能够改善低氧诱导对心肌细胞的损伤作用,促进抗凋亡因子Bcl-2的生成,抑制促凋亡因子Caspase-9和Caspase-3的生成,进而提高细胞活力以及抑制细胞凋亡过程;(2)葛根素可能通过激活PI3K/AKT和AMPK信号通路发挥心肌细胞的保护作用;(3)葛根素预处理能够促进Sirt1的表达,进而抑制低氧诱导对H9c2细胞凋亡的促进作用。(4)葛根素可能通过上调Sirt1的表达改善低氧诱导对心肌细胞中PI3K/AKT和AMPK通路的阻断作用。