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研究背景：胰腺癌是一种发病隐匿、进展快、预后极差的恶性肿瘤。目前临床早期诊断困难，治疗效果不佳。胰腺癌相关膜抗原在实现细胞生物学功能等方面具有十分重要作用，并且目前已有研究证明胰腺癌患者血清内确实存在肿瘤相关抗原的自身抗体，如能够通过膜生物学、细胞组分蛋白质亚组学、免疫蛋白质组学、膜蛋白质组学等方法，大量筛查寻找到特异性较好的胰腺癌相关免疫原性膜抗原，则可为胰腺癌的早期临床血清标志物诊断、分子影像诊断及免疫靶向治疗等发挥重要作用。研究目的：筛查胰腺癌相关免疫原性膜抗原，并对筛查出的候选膜抗原进行多层面的有效性验证及相关功能的探讨及研究。研究方法：大量培养、提取并纯化经典胰腺癌细胞株SW1990的膜蛋白，将膜蛋白通过二维双向凝胶电泳(2-DE)进行分离，平行的2-DE凝胶分别行考马斯亮蓝染色和免疫印迹杂交(Western Blot)。收集并纯化临床上66例胰腺癌、24例慢性胰腺炎患者血清中的IgG，分别与膜蛋白2-DE平行凝胶进行免疫印迹杂交。杂交阳性蛋白位点应用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析与肽质指纹库(PMF)鉴定。应用NCBI、SWISS-PROT／TrEMBL、ExPASy等网络数据库，对候选膜蛋白的基因序列、蛋白序列、蛋白结构域、疏水性、蛋白功能等生物学信息进行查询、分析，寻找其作为胰腺癌相关膜抗原的生物信息学依据。应用RT-PCR、Real-Time PCR、Western Blot等方法，分别在细胞株、组织层面，从基因与蛋白质两个水平对筛查出的膜抗原进行有效性验证，并比较不同胰腺癌细胞株、正常胰腺组织和胰腺癌组织中目的膜抗原的基因及蛋白表达水平的差异。应用siRNA干扰技术使目的VDAC1基因表达敲减或沉默，探讨、研究膜抗原VDAC1与细胞生长增殖、细胞调亡等方面的关系。同时成功的完成了对胰腺癌细胞株SW1990膜蛋白表达的有效性分析。实验结果：1．胰腺癌细胞株SW1990膜蛋白与胰腺癌患者血清IgG免疫印迹杂交共出现9个阳性点，与慢性胰腺炎IgG杂交所出现的2个阳性点无重复；质谱分析鉴定出6个候选膜抗原：VDAC1、VDAC2、VDAC3、Prohibitin、Prohibitin2、COMT。2．VDAC1、2、3为线粒体外膜蛋白，与线粒体物质运输、受体-配体识别、信号转导等多方面功能有关；Prohibitin(PHB)、Prohibitin2为线粒体内膜蛋白，抑制细胞DNA的合成，与细胞增殖密切相关。COMT与甲基团的转运及细胞内源性物质的代谢作用密切相关。3．RT-PCR和／或Real-Time PCR实验证明，候选膜抗原VDAC1、VDAC2、VDAC3、Prohibitin、Prohibitin2和COMT的基因在胰腺癌细胞株SW1990、AsPc、P3和Panc-1中均有表达。并且经Western Blot实验证明VDAC、VDAC1、VDAC2和COMT在胰腺癌细胞株SW1990、AsPc和P3中的蛋白表达水平均明显高于正常胰腺组织。4．Real-Time PCR实验证明，候选膜抗原VDAC1和Prohibitin2的基因在验证的10例正常胰腺组织和胰腺癌组织中均有表达(100％)，并且VDAC1和Prohibitin2分别在4例胰腺癌组织(Ca3、7、8、9)和3例胰腺癌组织(Ca3、8、10)中的DNA表达水平明显高于各自的正常胰腺组织。5．候选膜抗原VDAC1和Prohibitin2在组织中蛋白表达的Western Blot有效性验证结果表明，VDAC1和Prohibitin2在胰腺癌组织中的蛋白表达水平均明显高于正常胰腺组织，二者蛋白表达水平的差异均具有显著的统计学意义(p＜0.05)。6．干扰VDAC1的siRNA／pRNAT-H1.1／Hygro真核表达载体稳定、作用特异，Western Blot验证转染96h时干扰效率最佳(62.5％)。7．MTT法测定生长曲线和平板克隆形成实验结果表明，经RNAi的胰腺癌细胞SW1990的细胞生长增殖明显受到抑制(p＜0.01)。8．流式细胞仪检测siRNA干扰后的SW1990细胞凋亡的实验结果表明，VDAC1-siRNA转染后的胰腺癌SW1990细胞调亡数目明显增加。9．RNAi实验证明，膜抗原VDAC1与凋亡相关基因bcl-xl、caspase-3、Bax、PARP密切相关，VDAC1目的基因沉默或敲减后，细胞凋亡机制上调、活跃。10．Prohibitin-siRNA的序列设计特异、有效，可显著敲减目的Prohibitin的基因表达。11．完成了对胰腺癌细胞株SW1990膜蛋白表达的有效性分析。实验结论：1．VDAC1、VDAC2、VDAC3、Prohibitin、Prohibitin2、COMT可能为胰腺癌相关免疫原性膜抗原。2．VDAC1、2、3为线粒体外膜蛋白，与线粒体物质运输、受体-配体识别、信号转导等多方面功能有关；Prohibitin(PHB)、Prohibitin2为线粒体内膜蛋白，抑制细胞DNA的合成，与细胞增殖密切相关。COMT与甲基团的转运及细胞内源性物质的代谢作用密切相关。3．候选膜抗原VDAC1、VDAC2、VDAC3、Prohibitin、Prohibitin2和COMT的基因在胰腺癌细胞株SW1990、AsPc、P3和Panc-1中均有表达。并KVDAC、VDAC1、VDAC2和COMT在胰腺癌细胞株SW1990、AsPc和P3中的蛋白表达水平明显高于正常胰腺组织。4．候选膜抗原VDAC1和Prohibitin2的基因在验证的10例正常胰腺组织和胰腺癌组织中均有表达(100％)，并且在部分胰腺癌组织中呈显著性高表达。5．候选膜抗原VDAC1和Prohibitin2蛋白在验证的正常胰腺组织和8例胰腺癌组织中均有表达(100％)，而且在胰腺癌组织中蛋白水平呈显著性高表达(p＜0.05)。6．VDAC1参与细胞的生长增殖，呈正相关；VDAC1参与细胞凋亡调控机制，呈负相关。7．完成了对胰腺癌细胞株SW1990膜蛋白表达的有效性分析。