目的：　　 脑的毛细血管又称脑微血管,属连续性血管,以网状存在于脑实质内,在脑微血管内侧壁分布着毛细血管内皮细胞(BMEC),它是一层单层细胞,之间以紧密连接封闭。脑微血管内皮细胞的血管发生与性状改变与很多神经和血管疾病密切相关。　　 血脑屏障(Blood-brain Barrier,BBB)由脑毛细血管内皮细胞、基膜和神经胶质膜构成,属于一种代谢和生理性屏障结构。其中脑微血管内皮细胞(BMEC)是构成血脑屏障的主要结构,它将中枢神经系统的微环境与外周循环系统分隔开来,可阻止多种物质进入脑,但营养物质和代谢产物可顺利通过,以维持神经系统内环境的相对稳定。与外周血管内皮细胞不同,它具有高跨内皮阻抗(transendothelialelectrical resistance,TEER)、细胞间紧密连接、极少的胞饮小泡、缺乏窗孔结构以及含有选择性双向跨细胞膜转运系统等独有的特征,从而使血脑屏障形成一个限制大多数极性分子和蛋白质运动的选择性低渗透性的屏障。由于高能量需要和缺乏内源性能量来源,脑组织高度依赖持续的血液供应,所以血管内皮细胞的破坏和血流灌注不足可以严重影响神经活动。血脑屏障对于维持正常的中枢神经系统功能非常重要。　　 血脑屏障处于大脑微血管内皮细胞水平,其特点是限制细胞间扩散,减少胞吞作用和离子、多肽、营养成分特殊运载体的出现,这使得中枢神经系统的稳定性受到严密控制。血脑屏障这些特点由血管内皮细胞之间的相互作用、基底膜和星形胶质细胞足底过程调节控制。目前,关于BMEC血管发生的研究较少,对于BMEC血管发生的分子机制,BMEC血管发生与BBB形成以及BMEC紧密连接形成的关系,尚不清楚。　　 Eph受体和其配体ephrin都是膜结合蛋白,是细胞.细胞间信号传递的重要介质,调节着细胞的黏附,塑形,迁移。Eph受体家族是酪氨酸受体家族中最大的亚族,共有14个成员,根据序列相似性和与配体结和力不同分为A、B两族。A族配体通过GPI位点与膜结合,B族通过一个跨膜区与膜结合,有PDZ末端。近年的研究表明,Eph受体/ephrin配体存在于血管内皮细胞上,尤其是Eph受体/ephrin配体在肿瘤新生血管中的作用机制研究较多。但是Eph受体/ephrin配体是否在脑微血管内皮细胞(HBMEC)上表达以及它的特点和作用机制,尚不清楚。　　 综上,我们首先探讨EphA受体与ephrin-A配体在HBMEC上的表达谱,阐明哪些EphA受体与ephrin-A配体在HBMEC上表达。然后选取感兴趣的一个EphA受体,探讨其与紧密连接和血管发生的关系及相关机制。这项研究对于脑血管疾病及神经系统疾病的预防和治疗提供了一定的理论基础。　　 方法：　　 一、确定EphA受体/ephrin-A配体家族在HBMEC上的表达谱　　 (一)细胞培养　　 HBMEC细胞培养于含10％胎牛血清,10％Nu血清的RPMI1640培养液。　　 (二)巢式PCR技术定性检测EphA受体/ephrin-A配体家族在HBMEC上的mRNA表达情况。　　 (三)克隆测序　　 (四)RT-PCR技术检测EphA受体/ephrin-A配体家族在HBMEC上的mRNA表达情况。　　 1、HBMEC生长在35mm塑料培养皿内,待细胞融合成单层后,用Trizol裂解细胞制成细胞裂解液,反转录成cDNA。　　 2、用HBMEC的cDNA作模板,分别用EphA1-EphA8,EphA10,ephrin-A1-ephrin-A5,的各自引物,用PCR的方法检测EpkA/ephrin-A受体/配体家族在HBMEC上的核酸表达情况。　　 (五)Western Blot技术检测EphA受体/ephrin-A配体在HBMEC上的蛋白表达情况。　　 1、HBMEC生长在25cm2克氏瓶内,待细胞融合成单层后,用RIPA裂解细胞制成细胞裂解液。　　 2、用Western Blot的方法检测EphA受体/ephrin-A配体家族在HBMEC上的蛋白表达情况。　　 (六)用统计学方法分析每个EphA/ephrin-A受体/配体在HBMEC上的核酸表达水平和蛋白表达水平的相对多少。　　 二、探讨EphA2对BBB的紧密连接形成的作用　　 (一)用免疫沉淀的方法检测ephrin-A1配体分别与EphA家族受体互作时各个受体的磷酸化情况。　　 1、将生长状态良好的HBMEC种植在100mm塑料平皿上,待细胞融合至100％时,血清饥饿24小时后,按2.5μg/ml加入ephrin-A1蛋白纯品,作用30min后收样。　　 2、按照免疫沉淀的方法,先用酪氨酸磷酸化抗体“拉”,再分别用可以在HBMEC上表达的EphA1-EphA4,EphA6,EphA7抗体“杂”。　　 3、用Western Blot的方法检测ephrin-A1配体分别与EphA家族受体互作时各个受体的磷酸化情况。　　 (二)建立EphA2干扰的HBMECs稳定转染细胞株(EphA2siRNAs)　　 EphA2 siRNAs稳定转染HBMECs的细胞株,并用Western-Blot方法鉴定。　　 (三)真核表达载体构建,Lipo2000稳定转染HBMECs,建立EphA2激酶失活的HBMECs细胞株(即HBMECEphA2 K646M)　　 1、重组质粒pcDNA3.1/Myc-his B-EphA2 K646M的构建　　 2、真核表达载体构建。　　 3、稳定转染HBMECs细胞株。　　 (四)血脑屏障体外模型的建立及HBMEC单层通透性研究　　 1、将培养的HBMEC在生长状态良好时,按2×105/ml加到Transwell上室,Transwell下室加入0.8ml培养液,待细胞长成为具有紧密连接的内皮细胞单层时,即BBB模型建立。　　 2、TEER的分析将正常HBMEC、EphA2干扰的HBMECs细胞株HBMECEphA2siRNA与EphA2激酶失活突变株HBMECEphA2 K646M(转染EphA2激酶失活鉴定成功)分别接种到Transwell建立BBB模型,3天后测定跨上皮细胞电阻(TransEpithelial Electrical Resistance,TEER)。　　 3、HRP flux分析　　 (1)将正常HBMEC、EphA2干扰的HBMECs细胞株HBMECEphA2 siRNA与EphA2激酶失活突变株HBMECEphA2 K646M(转染EphA2激酶失活鉴定成功)分别接种到Transwell建立BBB模型。　　 (2)采用示踪分子HRP穿过HBMEC单层。　　 (3)酶标仪读取OD492值。　　 (五)免疫荧光技术检测紧密连接蛋白ZO-1的表达　　 1、将HBMEC,EphA2干扰的HBMECs细胞株HBMECEphA2 siRNA与EphA2激酶失活突变株HBMECEphA2 K646M(转染EphA2激酶失活鉴定成功)分别接种到盖片上。　　 2、待细胞长满后2-3天时,通过免疫荧光法观察紧密连接蛋白ZO-1分布。　　 (六)免疫荧光技术检测紧密连接蛋白Occludin的表达　　 1、将HBMEC,EphA2干扰的HBMECs细胞株HBMECEphA2 siRNA与EphA2激酶失活突变株HBMECEphA2 K646M(转染EphA2激酶失活鉴定成功)分别接种到盖片上。　　 2、待细胞长满后2-3天时,通过免疫荧光法观察紧密连接蛋白Occludin分布。　　 (七)Western Blot检测可溶性与不可溶性Occludin表达的变化　　 1、对HBMEC进行occludin抽提　　 2、用Western Blot的方法检测HBMEC和加入ephrinA1配体的HBMEC中可溶性occludin与不可溶性occludin的蛋白变化情况。　　 三、探讨EphA2对BBB的血管发生的作用　　 (一)细胞培养　　 1、HBMEC细胞培养于含10％胎牛血清,10％Nu血清的RPMI1640培养液。　　 2、siRNA干扰EphA2的细胞株HBMECEphA2 siRNA培养于含10％胎牛血清,10％Nu血清的RPMI1640培养液(使用时按6gμl/ml加入G418)。　　 3、EphA2激酶失活～HBMEC细胞株HBMEC EphA2 K646M培养于含10％胎牛血清,10％Nu血清的RPMI1640培养液(使用时按6μ/ml加入G418)。　　 (二)划痕法(scratch wound assay)检测内皮细胞迁移　　 1、检测HBMEC与加入ephrinA1配体的HBMEC的细胞迁移变化情况。　　 2、检测siRNA干扰EphA2的细胞株HBMECEphA2 siRNA与non-silence细胞株的细胞迁移变化情况。　　 3、检测EphA2激酶失活的HBMEC细胞株HBMEC EphA2 K646M细胞与vector细胞株的细胞迁移变化情况。　　 (三)血管生成实验　　 1、将HBMEC,EphA2干扰的HBMECs细胞株HBMECEphA2 siRNA与EphA2激酶失活突变株HBMECEphA2 K646M(转染EphA2激酶失活鉴定成功),按105/ml分别种到24孔板里的matrigel上。　　 2、在0h,4h,8h,12h,24h分别用倒置显微镜拍照。　　 3、用统计学的方法分析差异。　　 结果：　　 一、EphA受体/ephrin-A配体家族在HBMEC上共有11个成员表达　　 (一)EphA1-EphA4,EphA6,EphA7,EphA10,ephrin-A1,ephrin-A3-ephrin-A5在HBMEC上表达。　　 (二)其中EphA2,EphA7,ephrin-A1,ephrin-A3表达较高。　　 二、EphA2的Knock down或功能缺失突变促进紧密连接的形成　　 (一)EphA2干扰的HBMECs细胞株HBMEC EphA2 siRNA的TEER比non-silence的阻值高;HRP Flux比non-silence的低。　　 (二)EphA2激酶失活突变株的HBMEC EphA2 K646M的TEER比vector的阻值高;HRP Flux比vector的低。　　 (三)EphA2干扰的HBMECs细胞株HBMEC EphA2 siRNA和EphA2激酶失活突变株的HBMEC EphA2 K646M在加入配体ephrin-A1后,紧密连接保持完整。　　 (四)正常HBMEC、non-silence和vector细胞株在加入配体ephrin-A1后,紧密连接遭到破坏。　　 三、EphA2的Knock down或功能缺失突变抑制血管生成　　 (一)EphA2干扰的HBMECs细胞株HBMEC EphA2 siRNA的血管发生受到抑制。　　 (二)EphA2激酶失活突变株的HBMEC EphA2 K646M的血管发生受到抑制。　　 (三)EphA2干扰的HBMECs细胞株HBMEC EphA2 siRNA经过24小时后愈合程度明显低于non-silence细胞,48小时后non-silence细胞基本愈合。　　 (四)EphA2激酶失活突变株的HBMEC EphA2 K646M经过24小时后愈合程度明显低于vgctor细胞,,48小时后vector细胞基本愈合。　　 结论：　　 (一)EphA受体/ephrin-A配体家族在HBMEC上共有11个成员表达,包括EphA1-EphA4,EphA6,EphA7,EphA10,ephrin-A1,ephrin-A3-ephrin-A5。　　 (二)EphA2的过度活化在脑微血管内皮细胞间紧密连接的形成中起负调控作用,而在HBMEC的血管发生中起正调控作用。