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目的:观察糖尿病大鼠不同时期穹窿下器(SFO)的室管膜细胞的分泌情况和形态学变化以及NF-κB在SFO室管膜细胞中的表达情况。
方法:选择健康雄性Wistar大鼠60只,体重200g~220g,随机分为四组:①对照组(n=15):不做任何处理;②用药2周组(n=15);③用药4周组(n=15);④用药8周组(n=15)。
1.糖尿病动物模型的制作Wistar大鼠腹腔注射链脲佐菌素(Streptozotocin,STZ),建立Ⅰ型糖尿病模型。
2.光镜标本制备:常规经心灌注、固定、取脑,冠状方向去除视交叉以前和漏斗柄以后部分,取中间脑块,常规石蜡包埋,连续石蜡切片,片厚5um。常规HE染色、NF-κB免疫组化染色、封片。显微镜观察、照相。
3.电镜标本制备:麻醉、灌注同光镜标本制备,但灌注液为含2%多聚甲醛和2.5%戊二醛的混合磷酸缓冲液。取包含SFO的脑块用PBS冲洗,梯度酒精脱水,叔丁醇置换,真空干燥、喷金,日立S-3500N观察、照相。透射电镜样品制备与扫描电镜样品制备相同,取下SFO,放入4%戊二醛固定,1%饿酸后固定,树脂包埋,切片,T-S7500透射电镜观察、照相。
4.统计学处理:NF-κB阳性细胞采用麦克奥迪数码医学图像分析系统(Motic Med6.0)测定光密度。数据用均数加减标准差((-χ)±s)表示。应用SNK-q检验,进行两两比较,以P<0.05为有显著性差异。
结果:
1.模型制备:实验动物给予链脲佐菌素(STZ)腹腔注射后随机血糖值大于16.7mmol/L,并伴有“三多一少”症状,糖尿病动物模型制备成功。
2. HE染色结果观察:
2.1 正常对照组:SFO室管膜细胞为单层排列,胞核大小不一,多呈梭形或椭圆形。
2.2 模型组:在用药2周组,SFO室管膜细胞呈双层排列,排列紧密,胞核大小不一,大胞核较少,多呈圆形;小胞核较多,多呈梭形或三角形。室管膜下细胞较多,胞体较小。在用药4周组,SFO背内侧区、室管膜及室管膜下细胞分布密集,胞核较大而且染色深:中央区细胞分布较稀疏,胞核淡染,血管扩张明显。在用药8周组,SFO两侧大血管处室管膜细胞呈双层或多层排列,中央部室管膜细胞单层排列,排列紧密,室管膜下细胞稀疏。
3. NF-κB免疫组织化学染色结果观察
3.1 正常对照组:SFO内NF-κB免疫阳性细胞稀少,胞核呈浅棕黄色,弱阳性。散在分布于两侧大血管的周围,平均光密度为156.42±7.25。
3.2 模型组:在用药2周组,NF-κB免疫阳性细胞在SFO内均匀分布,核呈棕褐色,强阳性,平均光密度为183.72±8.35。在用药4周组,NF-κB免疫阳性细胞在SFO中央部细胞核轮廓不清,而周边部细胞核较清晰,室管膜细胞呈棕褐色,平均光密度为169.55±5.84。在用药8周组,免疫阳性细胞稀少,胞核呈棕黄色,弱阳性,主要分布于两侧部大血管周围,平均光密度为158.32±8.72。在用药2周组、用药4周组与对照组光密度测定结果比较均有显著性差异(P<0.05)、用药8周组与正常对照组无显著性差异(P>0.05)。
4.扫描电镜观察结果:
4.1 正常对照组:对照组:SFO为一尖朝向嘴侧,底朝向尾侧的三角形无纤毛区域。室管膜表面凹凸不平,与周围分界清楚。
4.2 模型组:在用药2周组,室管膜细胞边界清晰,有些细胞饱满、有些细胞扁平,细胞表面可见到圆形小破孔;有的细胞排列松散,界限清楚,细胞表面有茂密的微绒毛。在用药4周组,室管膜细胞表面凹凸不平,出现皱褶,细胞膜可见大小不一的多个小破孔,并可见细胞膜缺失、细胞器裸露的细胞;有些细胞表面光滑,可见大量密集大小不等的分泌颗粒,多呈乳头状。在用药8周组,有的室管膜细胞表面褶皱明显,可见球形分泌颗粒;有的室管膜细胞呈菜花状,在微绒毛的表面出现密集带蒂的分泌颗粒。
5.透射电镜观察结果:
5.1 对照组:SFO室管膜细胞脑室面完整,有少量的微绒毛和乳头状微突起,室管膜细胞之间可见紧密连接,室管膜细胞呈柱状,排列规则。
5.2 模型组:室管膜细胞之间可见缝隙连接,缝隙宽窄不等,呈锯齿状,胞核内异染色质较多,“边集”现象明显,室管膜面可见较多分泌颗粒。
结论:①首次在电镜下观察到SFO在糖尿病时室管膜细胞的超微结构发生变化,主要表现为分泌颗粒明显增多。②糖尿病时SFO的NF-KB免疫阳性细胞的分布有明显区域差异,免疫阳性细胞的光密度测定结果为:2周组光密度>4周组光密度>8周组光密度。③成功制备了糖尿病大鼠动物模型。