目的1.探讨染色体微阵列分析技术(chromosome microarray analysis,CMA)在早期自然流产患者流产绒毛染色体分析的应用价值。2.分析孕妇的年龄因素及胚胎性别因素对早期自然流产的影响。探讨自然流产孕妇的年龄及自然流产胚胎性别与各种染色体异常的关系。方法1.选取自2014年1月至2017年1月在广州市妇女儿童医疗中心就诊,年龄在22~44岁之间,以末次月经计算孕周在6~12周之间,经B超检查发现胚胎停止发育,明确诊断为自然流产的孕妇共335例。收集其自然流产绒毛组织。同时收集该孕妇的外周血标本。2.分别从患者流产绒毛组织及外周血中提取基因组DNA,检测所提取的基因组DNA的浓度和纯度。3.用荧光定量聚合酶链技术(Fluorescence quantitative polymerase chain reaction,QF-PCR)初步检测流产绒毛样本是否为13-三体、18-三体、21-三体或性染色体X单体。在21号,18号,13号及性染色体上选择2-4个短串联重复序列(Short tandem repeats,STR),以此作为靶序列设计合成引物,然后标记上不同的荧光染料。以样本中人类基因组DNA(Human genome DNA,g DNA)为模板进行PCR扩增。扩增后的PCR产物毛细管电泳。通过对电泳结果的分析以及计算机机软件的换算,得出不同的STR位点基因峰。分析每一个基因峰的数量或等位基因峰值面积的比值,判断21号,18号,13号及性染色体数目有无异常。同时检测孕妇外周血样本,通过STR峰型对比来判断介入性穿刺胎儿样本有无母体组织细胞污染。4.用美国Affymetrix公司的Cyto Scan 750芯片平台检测样本有无拷贝数变异片段(Copy number variants,CNVs)异常。该平台以大量SNP位点序列作探针,将其吸附在固相载体上制备成微阵列芯片。检测样本时,对待检样本DNA进行酶切、连接、扩增、产物纯化、片段化、荧光标记处理。再将待检样本DNA杂交到芯片。用CHAS软件扫描芯片各个探针上不同的荧光强度,并让之与一整套对照资料进行比对,从而计算该位置待测样本基因组DNA的含量。5.通过把CMA检测出来的CNVs与以下数据库中的信息进行比对,判断CNVs的性质。比对数据库分别为:含正常人的CNVs的DGV数据库(Database of Genomic Variants);含患者的表型及致病性片段的DECIPHER数据库(Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources);含已知的致病基因的OMIM(0nline Mendelian Inheritance in Man);含良性与致病性的CNVs的CAGdb(Cytogenomics Array Group database)和ISCA(International Standards for Cytogenomic Arrays);显示片段中基因的内容及功能的UCSC Genome Browser(University of Canlifonia Santa Cruz Genome Browser)以及PUBMED文献数据库。6.流产绒毛CMA结果提示染色体缺失/重复5M以上的病例,收集夫妻双方外周血标本做染色体核型分析。结果1.QF-PCR结果:在335例自然流产患者的流产物样本中,没有绒毛组织或真绒毛组织结构不清晰的33例,其余病例均能取到清晰的绒毛组织,并进行了QF-PCR检测。QF-PCR检测提示存在母体细胞污染的7例。295例病人绒毛组织中QF-PCR检出异常结果76例,异常率25.8%。其中13-三体5例,18-三体5例,21-三体16例(其中3例只有一条X染色体)。性染色体异常28例,其中只检测到一条X染色体的有25例,检测到多一条Y染色体的1例,性染色体嵌合的2例。多倍体22例。2.CMA结果:295例自然流产患者的绒毛组织进行CMA检测,检测成功率100%。在检测成功的295例病人绒毛组织中,CMA结果未检出异常CNVs有96例,约占32.5%。存在异常和或不明确CNVs的199例,约占67.5%。其中染色体数目异常共165例,占总异常的82.9%。染色体数目异常类型主要为非整倍体异常(134/165),大部分表现为三体型(98/134),单体型(25/134)次之。在三体型中尤以16-三体多见,其次是22-三体。单体型则主要为45,X。而除染色体数目异常外,CMA结果存在致病性CNVs的16例,约占总异常的8.0%。CMA结果存在不明确CNVs的18例,约占总异常的9.1%。3.致病性CNVs:本研究检出致病性CNVs24个,主要分布在3、5、20、22、X染色体上,片段长度在301kb-46870kb之间,涉及病例18例(其中2例合并染色体数目异常)。CNVs片段大小在5Mb以下的占58.3%(14/24),通过比对OMIM、ISCA、DECIPHER和Pub Med数据,诊断微缺失/微重复综合征4例。片段大小在5Mb以上的占41.7%(10/24),2例诊断为猫叫综合征。4.意义不明确的CNV(Variants Of Unknown Significance,VOUS):本研究检出VOUS62个,主要集中在4、5、6、10和22号染色体上,片段长度在204Kb~60640Kb之间,涉及病例51例。其中4例合并性染色体单体异常,19例合并常染色体三体异常,7例合并存在致病性CNVs,1例合并常染色体三体及性染色体单体异常。3例合并常染色体嵌合重复异常。而仅存在VOUS的有18例。5.夫妇双方染色体核型分析结果:CMA检出除多倍体、非整倍体以外,存在5M致病性CNVs以上的8例。其中,有4例的父母接受外周血染色体核型分析。夫妇双方染色体核型分析结果显示,3例的父母染色体核型正常;1例母亲为染色体平衡易位携带者。6.孕妇年龄与CMA结果的关系:本研究中自然流产孕妇的年龄在22~44岁之间,年龄中位数是31岁。以CMA结果把自然流产孕妇分成染色体数目异常组、致病性微缺失/微重复组、不明确微缺失/微重复组(VOUS)、正常及多态性CNVs组,分别比较各组孕妇年龄差异。其中,染色体数目异常组孕妇与正常及多态性组孕妇年龄的差异有统计学意义(P=0.008)。并且,孕妇在25岁以后,随着年龄的增高,流产绒毛染色体数目异常发生率增高;VOUS发生率降低;而致病性CNVs的发生率则没有明显变化。7.胚胎性别与CMA结果的关系:本研究295例自然流产孕妇绒毛CMA检测出男性胚胎149例,女性胚胎146例。男女胚胎比例为1.02∶1。以CMA结果把自然流产孕妇分成染色体数目异常组、致病性微缺失/微重复组、不明确微缺失/微重复组(VOUS)、正常及多态性CNVs组,比较各组胚胎性别差异。其中,正常/多态性CNVs组与染色体数目异常组胚胎性别差异有统计学意义(P=0.034);染色体数目异常组与VOUS组胚胎性别差异有统计学意义(P=0.006)。结论1.染色体非整倍体异常仍然是自然流产主要病因。2.孕妇年龄增长是导致自然流产的原因之一。25岁以上孕妇,随着孕妇年龄增长,孕妇因胎儿染色体数目异常导致流产的几率增加。胎儿发生染色体微缺失/微重复异常几率则与孕妇的年龄增长无关。3.自然流产胚胎没有明显的性别差异。然而,女性胚胎更容易发生染色体数目异常。男性胚胎则更容易发生染色体数目异常以外的染色体异常,以及更容易受染色体异常之外的其他因素影响而导致流产。4.CMA技术能提高早期自然流产绒毛染色体分析的检测成功率及异常检测率。可作为临床一线检测。