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细胞色素是一类广泛存在于生物体内、以血红素为辅基的重要电子载体。根据血红素辅基的构型特征，可以将细胞色素分为a、b、c、d四种主要类型，其中c型细胞色素是当前研究最广泛也最深入的一类细胞色素。该类细胞色素的典型结构特征是内部血红素分子通过保守的“C-X1-X2-CH”(X1，X2为任意氨基酸）结合方式固定于多肽链上。含有多个血红素的c型细胞色素是c型细胞色素家族的重要组成部分，主要存在于革兰氏阴性细菌的细胞周质。不同于结合单一血红素的c型细胞色素，多血红素c型细胞色素在细胞内除了可以作为电子传递载体外，部分还具有蛋白催化酶、电子容器、信号转导等生物学功能。 紫硫细菌Thermochromatium tepidum(Tch.tepidum)是一种嗜热型厌氧光合细菌，其光合反应中心为单一的TypeⅡ型。该细菌细胞周质中存在4种可溶性电子载体蛋白，即高电势铁硫蛋白(HiPIP)、细胞色素c、黄素细胞色素c552和低电势细胞色素c552(Low potential cytochrome，LPC)。其中，HiPIP、细胞色素c和黄素细胞色素c552的晶体结构已经完成解析，而LPC的三维空间结构尚不清楚。磁圆二色谱结果显示，LPC内部可能结合多个血红素分子。当前多血红素细胞色素结构与功能的相关研究报道还比较少。 本论文基于早期LPC相关研究基础，运用生物化学、分子生物学和X射线晶体学方法对LPC开展了更深入的研究，主要研究内容包括:(1)改进LPC样品制备方法;(2)LPC结晶条件筛选和优化，晶体X射线衍射、数据收集及结构解析;(3)LPC编码基因测序及多肽序列分析;(4)合作开展LPC样品电子顺磁共振(EPR)和液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)研究。 本论文取得的主要研究成果包括: 1.通过改进分离纯化方案，获得高纯度和高均一性LPC样品。相比于早期的分离纯化方案，本研究主要改进的内容包括:a.连续使用两次阴离子交换柱层析并将柱填料由弱阴离子交换介质(DEAE-650S)更换为强阴离子交换介质(Q-Sepharose HP)，同时将第二次阴离子交换柱层析的缓冲液由Tris-HCl(pH8.0)更换为Bis-Tris-HCl(pH6.0);b.改进了硫酸铵分步沉淀LPC样品的策略，即首先在低浓度的硫酸铵条件下去除部分杂蛋白，然后在较高硫酸铵浓度条件下将含有LPC的组分沉淀析出，去除含有杂蛋白的上清液;最后用适当浓度的硫酸铵溶液去除残留的杂蛋白。采用改进后的分离纯化方案得到的LPC样品经SDS-PAGE检测后显示仅有一条明显的条带。样品凝胶过滤层析检测呈单一洗脱峰，分子量约50kDa。氧化态LPC样品EPR光谱中存在5个明显的共振信号峰。 2.LPC编码基因测序及多肽序列分析。本论文共完成LPC编码基因起始密码子至下游编码区1305个碱基的测序，其对应编码435个氨基酸。多肽序列分析表明，在LPC N末端的前端存在一段由30个氨基酸构成的前导肽。通过氨基酸同源序列比对，在数据库中搜索到9个与LPC同源性高于60％的蛋白，然而这些同源蛋白的结构与功能都不明确。进一步对lpc基因起始密码子的上游序列进行测序，结果表明，在该细菌基因组中lpc基因的上游存在两个细菌氮代谢调节酶同源蛋白的编码基因。 3.LPC蛋白结晶及高分辨率晶体结构解析。采用坐滴法筛选并优化得到LPC晶体。在同步辐射光源SPring-8收集LPC晶体衍射数据。晶体相位通过Fe-SAD确定并最终解析了LPC的1.6(A)高分辨率晶体结构。该结构表明，LPC整体分子由一个血红素结合结构域和一个免疫球蛋白类似结构域构成。其中，血红素结合结构域包含五个紧凑排列的血红素分子(Heme1-Heme5)，相邻血红素分子中心铁原子间的距离均在9-12(A)，血红素分子的空间排列与已报道的多血红素细胞色素的血红素分子的空间排列存在部分相似。LPC中所有血红素分子均为六配位，除Heme2外，所有血红素分子的第五、六位配体均为组氨酸。特殊地，Heme2的第六位配体缺失，在晶体结构中其配位空间存在一团未知电子密度，本文据此推测Heme2可能为LPC的活性位点。Cys241和Arg232是该“活性位点”中两个重要的氨基酸，可能参与底物分子的结合以及催化反应的调节。在LPC蛋白表面存在一个与活性位点相通的碱性“氨基酸口袋”，可能作为底物分子进入活性位点的通道。免疫球蛋白类似结构域是LPC蛋白的另一显著结构特征，该结构域通常参与细胞识别或作为细菌糖苷酶的组成部分，在当前的细胞色素结构研究中尚没有结合免疫球蛋白类似结构域的报道。 蛋白质同源结构搜索结果显示，在已有数据库中并不存在与LPC具有较高同源性的蛋白结构，因此本研究解析的LPC结构代表了该类蛋白的第一个空间结构，为进一步分析LPC在细胞内的生理功能奠定了结构基础。为了鉴定LPC可能的底物分子，本研究尝试利用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)来分析LPC活性位点的底物分子的质量，然而，底物分子与LPC的结合可能在实验处理过程中遭到破坏，并未检测到底物分子信号。结合其他多血红素细胞色素的研究报道，本研究对LPC在紫硫细菌Tch.tepidum中的可能生理功能展开了讨论。