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柑橘属及枳属中有丰富的砧木资源,研究其抗性特性,从中挖掘优良的基因资源是将生物技术应用于柑橘抗性育种的重要措施。已有研究表明,多胺在植物形态建成和逆境应答中起重要作用。本研究利用高效液相色谱的手段,分析了外源施加腐胺对极耐寒砧木枳(Poncirus trifoliata)的影响,比较了不同抗性材料内源游离多胺的含量;利用生物信息学和RT-PCR的方法,克隆了多胺合成路径中的两个限速酶(S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶SAMDC及精氨酸脱羧酶ADC)的基因(命名为CsSAMDC和PtADC),结合Real-time PCR和Northern分析了它们在细胞分裂和不同逆境下的表达,确定了它们在柑橘体内的拷贝数,证实了SAMDC的生化活性;利用遗传转化的手段,将PtADC基因异源互补拟南芥ADC基因突变体,同时在柑橘体内超表达,初步鉴定了该基因的功能。主要结果如下:1、低温胁迫的枳中,精氨酸脱羧酶路径参与了腐胺的生物合成;腐胺能减轻低温带来的伤害,但过高的腐胺会产生毒害。实际应用中,可以加入低于1 mM腐胺用于提高柑橘的抗寒性。低温胁迫下,抗性材料总多胺含量增加,腐胺增加最明显;不抗材料总多胺含量下降,腐胺变化不明显;低温驯化下,枳多胺含量增加,腐胺和精胺增量最大;盐胁迫下,耐盐材料亚精胺增加明显,不耐盐材料总多胺含量下降,亚精胺、精胺降低明显。2、分离了纽荷尔脐橙S-腺苷甲硫氨酸脱羧酶的基因(CsSAMDC),序列分析表明该基因有几个共有的保守域,进化分析认为其功能可能与葡萄和苹果相近,原核表达和酶活分析证明本实验克隆的CsSAMDC具有脱羧酶的活性,是真正有功能的基因,Southern杂交显示该基因可能是一个等位基因,表达分析证实CsSAMDC在所有检测的器官(叶、花、果)中普遍存在,在细胞分裂中有作用,干旱胁迫下诱导表达,在抗性材料中响应快,持续时间长,可以作为候选基因用于柑橘遗传改良。3、分离了枳精氨酸脱羧酶基因(PtADC),序列分析表明该基因具有两个保守的氨基酸结构域,该基因与茄科关系最近,是一个单拷贝基因,在细胞生长中有作用,在所有检测的器官(叶、花、果)中普遍表达,受干旱、冷害诱导表达,抗性材料(抗冻、耐盐)中被诱导而不抗材料中被抑制。该基因异源互补拟南芥缺失突变体,转基因植株种子表现出较强的耐渗透能力;植株表现较强的耐旱性和耐冷性;转基因植株叶片气孔密度减少、根长增加,表现晚花。获得了转PtADC柑橘植株,初步研究表明叶片气孔密度降低、抗柑橘溃疡病。