论文部分内容阅读
目的:阿尔茨海默症(Alzheimer’s Disease, AD)是中枢神经系统最常见的一种神经系统退行性疾病,主要表现为渐进性记忆障碍、认知功能障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状,严重影响社会交往、就业与生活质量,给个人、家庭和社会带来沉重负担。AD的病因和发病机制十分复杂,至今尚不完全清楚。目前存在多种学说,如氧化应激学说、Aβ级联学说、Tau蛋白假说、线粒体功能障碍学说、基因突变学说和自噬功能失调学说等。miRNAs是体内重要的一种内源性非编码小RNA,通过与mRNA3’-UTR结合发挥转录后调节作用,在人体大约有20-30%的基因是受miRNA调控的。近年来,研究表明,miR-18b、 miR-325、miR-615等多个miRNAs在AD的发生、发展过程中发挥的重要调节作用。尽管如此,失调的miRNAs在AD发生发展中的作用机制尚不完全明确,是当前本领域研究的热点问题。本研究通过对快速老化小鼠(Senescence AcceleratedMouse-Prone/8, SAMP8)海马组织中miRNAs的表达谱进行分析,结合生物信息学、Real-time PCR和Western blot等方法,筛选并确定目标miRNAs及其靶基因,进一步采用荧光素酶实验观察miR-34c对其靶基因突触结合蛋白(Synaptotagmin-1,syt1)的负向调控作用。为阐明miR-34c在AD发生发展过程中的作用以及开发以miRNAs为靶点的药物提供了新的思路。方法:①法实验动物:封闭群清洁级快速老化亚系SAMP8及抗快速老化亚系SAMR1(Senescence accelerated Mouse-Resistant/1, SAMR1)。②②SAMRn表达谱的检测:采用miRNA基因芯片技术检测SAMP8和正常同龄对照SAMR1鼠海马组织中miRNA表达谱的改变情况。③③利用生物信息学方法进行KEGG分析,预测差异性表达的miRNAs可能参与的信号通路。④能差异性表达miRNA的验证:通过Real-time PCR验证目标miRNAmiR-34c在3月龄SAMP8和同龄对照SAMR1小鼠海马组织中的表达;进一步通过Real-time PCR检测miR-34c在3月龄SAMR1小鼠脑、心、肝、肾等组织的表达和3,6和9月龄SAMP8和同龄对照SAMR1小鼠海马组织中的表达及增龄性改变。⑤增利用生物信息学方法进行GO分析,预测miR-34c的靶基因可能的生物功能。⑥靶基因的预测及验证:利用miRNA靶基因数据库Targetsan6.2和Pictar、miRanda、RNA22、PITA综合预测miR-34c的靶基因,通过Real-time PCR检测3、6和9月龄SAMP8小鼠和正常同龄对照SAMR1小鼠海马组织中靶基因mRNA水平的表达,再分别通过Westernblot和免疫组化的方法对SAMP8和同龄对照SAMR1小鼠海马组织中靶基因蛋白的表达和定位进行分析。⑦行荧光素酶实验:最后通过构建靶基因3’-UTR荧光素酶报告载体,与miR-34c前体序列或抑制物共同转染HEK-293细胞,通过双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性。⑧胞统计方法:所有数据采用x|-±s表示。用SPSS13.0软件进行数据处理,采用方差分析和独立样本t检验进行统计学分析,以P <0.05为有统计学意义。结果:①果miRNA芯片结果:与正常同龄对照SAMR1相比,SAMP8海马组织中表达差异在1.5倍以上的miRNAs有15个,其中7个表达下调,8个表达上调,且以miR-34c表达上调倍数最高,为2.52倍。②。对差异性表达的miRNAs进行的KEGG结果提示:差异表达的miRNAs的靶基因可能参与机体神经营养因子信号通路、轴突导向和突触囊泡循环等信号通路,以及神经元突触的形成过程。③靶Real-time PCR检测显示,与同龄正常对照组SAMR1小鼠相比,3月龄SAMP8小鼠海马组织中miR-34c表达增高(P<0.05),与芯片结果一致;miR-34c在小鼠海马和脑皮质中的相对表达量明显高于心、肝、肾组织(P <0.05);与正常同龄对照组SAMR1相比,3,6和9月龄SAMP8小鼠海马组织中miR-34c表达均显著增高(P <0.05),且在SAMP8组呈增龄性表达增高(P <0.05)。④④0.分析结果提示,miR-34c的靶基因可能参与轴突导向、神经系统的发生等过程,并且参与突触结构的组成过程。⑤软件预测miR-34c靶基因为突触结合蛋白1(Synaptotagmin1,syt1),Real-time PCR检测3,6和9月龄SAMR1和SAMP8海马组织中syt1mRNA水平随着月龄的增加而增高(P <0.05)。⑥Western blot检测结果显示,与正常同龄对照组SAMR1相比,3,6和9月龄SAMP8小鼠海马组织中SYT1蛋白水平明显下调,且呈增龄性下降(P <0.05)。免疫组化结果显示,SYT1蛋白主要表达在小鼠海马组织的CA3区,DG区和CA1区几乎没有阳性表达。⑦达双荧光素酶活性检测结果显示,与阴性对照组相比,转染miR-34c前体组,荧光素酶活性明显减低,转染miR-34c抑制物组荧光素酶活性增高(P <0.05)。结论:①论SAMP8小鼠海马组织中多种miRNAs表达失调,可能通过神经营养因子信号通路、轴突导向和突触囊泡循环通路参与脑老化及神经系统退行疾病的发病过程。②行miR-34c可抑制其靶基因syt1蛋白的翻译在AD发生发展过程中发挥重要作用。