背景和意义心血管疾病是导致人类死亡的首要原因。通过血管移植对受损血管进行替换是治疗心血管疾病的主要途径。然而,当前合适的自体血管移植物来源有限,并且生物降解聚合物小口径人工血管(内径≤5 mm)在移植后由于表面缺乏功能内皮化容易发生血栓及内膜增生,从而影响了长期通畅率。近年来,通过体外在聚合物人工血管表面种植自体细胞构建组织工程血管以提高小口径人工血管的内皮化和长期通常率得以发展。然而,体外通过细胞培养种植构建组织工程血管,在细胞收集和培养方面耗时、耗力、耗材,且存在较高的风险,因此利用机体天然再生机制,构建可以自主招募内源性细胞且具有原位血管再生潜能的人工血管成为当前研究的主要方向。天然血管中的细胞外基质对于血管的结构和功能有着重要的生理学功能,且内源性的内皮祖细胞(EPC)和内皮细胞(EC)在新血管形成过程中扮演着重要的角色。因此,当前多种功能性的生物分子已经被用于修饰聚合物人工血管,构建类似于细胞外基质的功能性人工血管表面,从而自主招募内源性的EPC和EC。然而,这些功能性分子存在很多弊端,如缺乏对于EPC和(或)EC结合的高特异性和高亲和力,从而容易导致其它不利细胞粘附在血管表面形成血栓;缺乏对于EPC和(或)EC的功能性,难以促进细胞的生长和组织的再生;体内稳定性较低,从而大大降低了其在体内的功能性。One-bead one-compound(OBOC)组合文库技术是一种高通量的化学文库合成及筛选技术,可以广泛地用于多种生物功能性受体的配基的合成和筛选。在应用OBOC技术筛选小分子化合物过程中,可以通过设计主要功能基团周边氨基酸残基不同的空间结构,从而提高筛得小分子肽对于目标靶分子结合的特异性和亲和力。同时,在利用OBOC技术筛选合成小分子肽的过程中可以引入非天然氨基酸残基并实现环状结构,从而大大提高其在体内的稳定性。因此,本课题利用OBOC技术,针对对EPC和(或)EC功能具有重要影响的表面整合素分子,筛选合成对EPC和(或)EC具有高特异性、高亲和力、高功能性且体内具有高结构稳定性的生物小分子肽,并将它稳定地修饰于小口径人工血管支架表面,构建生物功能型人工血管。我们进一步证实该生物功能型人工血管移植动物体内后可以快速有效的招募内源性的EPC和(或)EC到血管移植物与血液接触的管腔表面,同时抑制其它不利细胞和蛋白的粘附,从而提高小口径人工血管的快速内皮化和长期通畅率。内容、方法和结果1.EPC和EC特异性结合小分子肽的筛选和鉴定方法:利用OBOC组合文库技术合成筛选针对EPC和(或)EC具有高特异性和高亲和力的功能性小分子肽;通过活细胞与修饰有筛得的小分子肽的树脂球结合实验测定筛得的小分子肽对于EPC和EC的结合的特异性;通过流式细胞技术比较筛得的小分子肽与传统的GRGD对于EPC和EC的结合特异性和亲和力的差异;通过表面粘附实验进一步测定和确定筛得的小分子肽与传统的GRGD对于EC的结合的特异性和亲和力的差异;通过测定αvβ3抗体封闭前后筛得的小分子肽对于EPC和EC的结合能力,评估筛得的小分子肽是否确实通过细胞表面整合素αvβ3与EPC和EC结合。结果:利用OBOC组合文库技术合成筛选了包含非天然氨基酸残基和二硫键的小分子八肽LXW7(cGRGDdvc);细胞和修饰有小分子肽的树脂球结合实验结果证明,LXW7对于不同来源的EPC和EC具有较强的结合能力,并且不结合THP-1单核细胞,与血小板结合非常微弱;流式细胞技术测定结果显示,与GRGD相比,LXW7具有与不同来源的EPC和EC更强的结合能力,LXW7和GRGD都不与THP-1单核细胞结合,值得关注的是,LXW7与血小板结合非常微弱,但GRGD却与血小板有较强的结合;表面粘附实验结果显示,与GRGD表面相比,EC更容易在LXW7表面粘附,LXW7和GRGD表面都不支持THP-1单核细胞的粘附,血小板在LXW7表面粘附非常微弱,但在GRGD表面有较强的粘附;整合素αvβ3抗体封闭实验显示,αvβ3在不同来源的EPC和EC表面均有很强的表达,利用αvβ3抗体对细胞封闭之前LXW7与EPC和EC都有很强的结合,但当利用αvβ3抗体对细胞封闭之后LXW7与EPC和EC的结合均有显著下降。这进一步确认了 LXW7是通过整合素αvβ3分子与EPC和EC结合的。2.LXW7对于EPC和(或)EC生物学功能及在体外模拟血流情况下粘附能力的影响方法:利用MTS分析测定LXW7对于EPC和EC增殖能力的影响;利用Western-blot测定LXW7对于EPC和EC功能相关的重要信号通路的影响;利用qPCR测定LXW7对于EPC分化成熟能力的影响;体外构建血流模拟装置,并利用其分别测定比较在血流剪切力存在的情况下EC在LXW7和纤维连接蛋白表面的滞留情况。结果:MTS测定结果显示,与在正常表面培养的EPC和EC相比,在LXW7表面培养的EPC和EC的增殖能力均有提高,但当将EPC和EC在LXW7表面培养一段时间然后将EPC和EC脱离LXW7表面自行培养时,细胞的增殖能力与在正常表面培养的EPC和EC相比并无差异;Western-blot结果显示,LXW7可以提高EC内VEGFR2的磷酸化,从而进一步提高细胞内ERK1/2的磷酸化,同时LXW7也可以提高EPC内ERK1/2的磷酸化;qPCR结果显示,利用LXW7处理后,EPC表达KDR、NOS3、CD144、vWF、JAG1、DLL1和HEY1无显著性变化,与成熟的EC相比,EPC表达KDR偏高,其它普遍偏低。在血流剪切力存在的情况下,EC可以在LXW7表面很好地滞留,并且强于EC在纤维连接蛋白表面的滞留。3.功能型人工血管的构建方法:利用静电纺丝技术构建人工血管支架;设计合成为影响LXW7结构和功能且有利于化学反应进行的LXW7衍生物;通过"click chemistry"方法将LXW7固定于人工血管支架表面;利用全反射-傅氏转换红外线光谱技术和氨基酸分析技术测定LXW7在人工血管支架表面的固定情况;体外测定EC在小分子肽修饰后的人工血管支架表面的粘附、增殖和铺展情况。结果:选取19%聚乳酸(PLLA)和5%聚己内酯(PCL)的混合物为原料,利用静电纺丝技术成功构建出结构类似于天然细胞外基质且机械强度与天然动脉血管相似的人工血管支架;成功合成不影响LXW7功能且有利于化学反应的LXW7生物素衍生物,并利用优化后的"click chemistry"反应体系将LXW7成功固定于人工血管支架表面;全反射-傅氏转换红外线光谱技术(ATR-FTIR)和氨基酸分析技术测定结果显示,LXW7已被高效地固定于人工血管支架表面;体外测定结果显示,与未经修饰的人工血管支架相比,LXW7修饰后的人工血管支架表面对EC的粘附有显著的提高,对EC的生长有显著的促进,并且支持EC的铺展。4.功能型人工血管体内的内皮化和通畅率研究方法:利用Sprague-Dawley(SD)大鼠的左侧颈总动脉为模型,分别在不同时间点测定LXW7表面修饰的功能型人工血管的内皮化程度和通畅率;并通过免疫组织化学进一步分析功能型人工血管在体内对于内源性EPC和EC的招募程度,以及功能型人工血管自身的内皮化速度和内皮覆盖率。结果:不同时间点通畅率测定结果显示,1周时,LXW7修饰组中,6只移植物全部保持通畅(100%),而未修饰组中却有一半已经堵塞,只剩3只保持通畅(50%);2周时,LXW7修饰组中有5只保持通畅(83.3%),而未修饰组中只剩1只保持通畅(16.7%);6周时,LXW7修饰组中依然有5只保持通畅(83.3%),而未修饰组中只有1只保持通畅(16.7%)。血管移植物内表面En face免疫荧光染色结果显示,1周时,LXW7修饰后的移植物已经有大量的细胞粘附,而未经修饰的移植物几乎无细胞粘附;2周时,LXW7修饰后的移植物细胞覆盖率迅速增加并且有组织化发生,而未修饰的移植物只有少量细胞粘附;6周时,LXW7修饰后的移植物几乎完全被细胞覆盖并且移植物整体正在逐渐实现组织化,而未经修饰的移植物细胞粘附程度相对较弱;经过对EPC表面标记CD34和EC表面标记CD31的荧光染色分析,结果显示,1周时,LXW7修饰后的移植物两端已经有大量的EC覆盖,与此同时,移植物中部和两端都有大量的EPC粘附,然而未经修饰的移植物几乎无细胞粘附;2周时,LXW7修饰后的移植物几乎已经完全被EC覆盖,并且同时依旧伴随对EPC的招募,而未修饰的移植物只有非常少量EC粘附并且缺乏对于EPC的招募功能;6周时,LXW7修饰后的移植物完全被EC覆盖,并且没有新招募的EPC,而未经修饰的移植物EC覆盖程度相对较低。人工血管移植物移植6周后,LXW7修饰后的人工血管表面有大量的微血管和(或)毛细血管生成,而未修饰的人工血管表面几乎无新生血管生成。移植6周后,HE染色结果显示,LXW7修饰后的人工血管具有较好通畅率,管壁只有微量血栓形成,而未经修饰的人工血管已几乎堵塞,有大量的血栓形成;移植6周后,对LXW7修饰后的移植物横切面针对EC表面的标记蛋白CD31荧光染色,结果显示,移植物的内壁和外壁都有大量的EC覆盖,且有大量的EC已经迁移至血管移植物的内部多孔结构。结论本课题通过解决当前小口径人工血管构建过程中存在的主要问题,成功构建功能型小口径人工血管,并在体内实现小口径人工血管自身的快速内皮化并获得长期通畅率,为设计和发展功能型小口径人工血管提供了新的思路,提高了临床应用的可行性,为心血管疾病的治疗提供了新的手段。(1)利用OBOC组合文库技术合成筛选得到了对EPCs和(或)ECs具有高特异性、高亲和力、高功能性和高体内稳定性的生物功能小分子肽LXW7。(2)在血流剪切力存在的情况下,EC在修饰有LXW7的表面依然可以很好地滞留,并且强于在纤维连接蛋白表面的滞留。(3)通过优化选择构建人工血管支架的聚合物材料,利用静电纺丝技术,构建出具有与天然细胞外基质相似、与天然动脉血管机械强度接近的人工血管支架。(4)优化设计出稳定高效的"click chemistry"反应体系,将LXW7高效稳定地固定于人工血管支架表面,成功构建功能型人工血管。(5)体内测定证明所构建的功能型人工血管实现了体内的快速内皮化和长期通畅率。