研究背景与研究目的急性肾损伤(AKI)是一组具有高致死率和高花费的临床常见病；其中,肾脏低灌注为AKI的主要发病因素。缺血再灌注(I/R)肾损伤常出现于肾脏移植、肾脏相关手术、肾脏疾病及创伤后,极易发展为慢性肾功能不全,并与一系列严重的肾外损伤相关。尽管有关肾脏I/R损伤的研究很多,目前针对缺血再灌注造成的急性肾损伤尚无有效治疗方式。一系列病理过程参与肾脏I/R损伤的发生,其中氧化应激是再灌注损伤中的始动因素。缺血再灌注损伤时,大量活性氧簇(ROS)生成,引起细胞内抗氧化物活性减低,DNA、脂质及蛋白质的结构和功能遭到破坏；并且有证据表明在猪肾脏I/R损伤模型中,8-oxodG (DNA氧化损伤标志物)表达上调。还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶是再灌注过程中ROS的主要来源,它由与细胞内膜结构结合的NOX异构体,p22phox亚基和存在于细胞质基质中的p47phox, p67phox, p40phox和Rac亚基组成。NOX4是肾脏中NADPH氧化酶表达量最丰富的类型,NOX2在肾脏也有表达。NOX4 和 NOX2的表达在猪肾脏I/R损伤中均明显上调。因此,恢复细胞内抗氧化防御系统活性及抑制NADPH氧化酶的激活有助于减轻氧化应激损伤程度。尽管肾小管上皮细胞坏死一直被认为是缺血性AKI的标志性改变,但是在人肾组织活检中,坏死细胞数量无法准确预测肾功能的恶化情况,并且越来越多研究表明,凋亡为缺血性AKI中另一种重要的细胞死亡形式,它能更好的预测肾功能的进展情况。在肾脏细胞中,I／R损伤激活Bax,促进其线粒体转位,增加线粒体外膜通透性,下调Bcl2表达,促进细胞凋亡。此外,近年来研究表明,过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)活化被认为是I／R损伤的重要治疗靶点,其激动剂可减少I／R损伤后组织中细胞凋亡水平,改善损伤组织功能。硝基脂肪酸是活性一氧化氮(.NO)及亚硝酸根离子(NO2)与不饱和脂肪酸发生氧化还原反应合成的衍生物,包括硝基油酸(OA-NO2)和硝基亚油酸(LNO2)。它们可与蛋白中的亲核氨基酸发生可逆的Micha el加成反应,介导-系列广泛的信号调节、血管保护、过氧化物酶体增殖物激活受体γ (PPARγ)活化、抗炎症反应及抗氧化应激作用。有研究表明,在心脏缺血再灌注损伤中,硝基脂肪酸可缩小心肌梗死范围,提高心肌细胞存活率；在肾脏缺血再灌注损伤中,硝基油酸可改善肾功能,下调肾组织中炎症反应及氧化应激水平。然而其肾脏保护的具体机制尚不明确。根据上述背景,本研究拟建立肾小管上皮细胞缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)模型来模拟肾脏缺血再灌注损伤,观察硝基油酸对OGD/R引起的细胞凋亡及氧化应激损伤的作用；并进一步探讨其抗凋亡、抗氧化的作用机制。研究方法1.为明确硝基油酸对缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)处理后肾小管上皮细胞凋亡的作用及机制,选取人肾小管上皮细胞系(HK-2),给予缺糖缺氧16小时后复糖复氧处理,以建立肾脏缺血再灌注损伤细胞模型。于复糖复氧后不同时间点采用CCK-8法检测细胞存活率；Annexin V/7-AAD双标法检测细胞凋亡水平,western blotting检测凋亡相关蛋白caspase3、cleaved caspase3、cleaved PARP表达变化。选取上述各指标变化最明显的时间点分别给予硝基油酸(OA-NO2,1.25μM)或油酸(OA,1.25 μM)处理,对照组给予与给药组相同体积的乙醇作用。然后采用CCK-8法、Annexin V/7-AAD双标法、Hoechst 33342染色法检测药物对细胞存活及凋亡的影响；Western blotting检测药物对凋亡相关蛋白c aspase3、 cleaved caspase3、cleaved PARP;线粒体组分和细胞质基质组分中Bax、Bcl2、细胞色素C(cyto C)、凋亡诱导因子 (AIF)； 以及存活信号通路蛋白phospho-Akt、Akt、phospho-Gsk 3β、Gsk3β蛋白表达水平的影响。免疫荧光染色检测药物对活化Bax表达变化的影响。最后,采用GW9662口siRNA干扰技术抑制PPARγ活性,观察上述指标的变化情况。2.为明确硝基油酸对缺糖缺氧／复糖复氧(OGD/R)处理后肾小管上皮细胞中氧化应激损伤的作用及机制,选取人肾小管上皮细胞系(HK-2),给予缺糖缺氧16小时后复糖复氧处理。于复糖复氧后不同时间点,采用DCFH-DA染色检测细胞内氧化应激水平,选取氧化应激水平最高的时间点分别给予硝基油酸(OA-N02,1.25μM)或油酸(O A,1.25μM)处理,对照组给予与给药组相同体积的乙醇作用。然后采用DCFH-DA染色及DHE染色检测药物对损伤后细胞内氧化应激水平的影响；JC-1染色检测药物对损伤后线粒体膜电位变化的影响；实时荧光定量RT-PCR及western blotting分别检测药物对损伤后抗氧化相关蛋白Nrf2、HO-1、GCLM.SOD1以及NADPH氧化酶亚基NOX4、NOX2、p22phox基因及蛋白水平表达变化的影响；ABTS法检测细胞总抗氧化能力变化；还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化法检测细胞内NADPH氧化酶活性变化。最后,采用siRNA干扰技术下调Nrf2基因及蛋白表达,观察上述指标变化。研究结果1.硝基油酸通过调控PPAR γ/Akt/Gsk-3β信号通路改善缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)诱导的肾小管上皮细胞凋亡1.1缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)损伤可逐步降低HK-2细胞存活率,增加细胞凋亡CCK-8结果显示,缺糖缺氧8、16、24小时,复糖复氧24小时处理后,细胞存活率分别为80.27±0.96%、51.62±1.37%和29.00±2.69%、Annexin V/7-AAD双标法及western blotting检测凋亡相关蛋白结果显示在缺糖缺氧16小时,复糖复氧3小时(H16R3)处理后,细胞凋亡率和凋亡相关蛋白表达水平最高(均P<0.01),因此本实验选取H16R3作为OGD/R模型条件。1.2硝基油酸而不是油酸提高缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)损伤后细胞存活率CCK-8结果显示,硝基油酸(2.5或51μM)作用20小时后, 与乙醇对照组相比,细胞增殖明显被抑制(均P<0.01)；而硝基油酸(0.5,0.75,1.25μM)对细胞增殖无明显作用。与OGD/R组相比,硝基油酸(1.25 μM)预作用可将细胞存活率由48.88±3.13%提升至61.17±4.90%(P<0.05),而油酸并无此作用。1.3硝基油酸缓解缺糖缺氧／复糖复氧(OGD/R)造成的细胞凋亡Annexin V/7-AAD双标、Hoechst 33342染色及western blotting结果显示：与OGD/R组相比,硝基油酸(1.25μM)预作用组细胞凋亡水平降低(P<0.001)；细胞核形态得到改善；cleaved caspase 3 和 cleaved PARP表达下调(均P<0.05)。1.4硝基油酸抑制缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)引起的Bax活化、线粒体转位及继发线粒体外膜通透性增加Western blotting分析线粒体/细胞质基质蛋白组分结果显示,与正常对照组相比,OGD/R组中线粒体组分Bax水平升高,细胞色素c和AIF水平下降,差异具有统计学意义(均P<0.05)；而细胞质基质组分Bax水平明显下降,细胞色素c和AIF水平明显升高,差异具有统计学意义(均P<0.01)。与OGD/R组相比,硝基油酸(1.25 μM)预作用组中线粒体组分Bax和细胞质基质组分细胞色素c和AIF水平均明显下降(均P<0.05)。免疫荧光结果显示,与正常对照组相比,OGD/R组细胞中活化Bax水平明显升高；而硝基油酸(1.25 μM)预作用组细胞中活化Bax水平较OGD/R组明显降低(均P<0.001)。1.5硝基油酸恢复缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)后Akt及Gsk 3β的磷酸化水平Western blotting结果显示,与正常对照组相比,OGD/R组中Akt及Gsk 3β磷酸化水平明显降低,差异具有统计学意义(均P<0.05)；而硝基油酸(1.25 μM)预作用组中Akt及Gsk 3β磷酸化水平恢复至接近正常水平。1.6 GW9662和PPARγsiRNA废除硝基油酸对缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)后HK-2细胞的保护作用Western blotting结果显示,与阴性对照si RNA转染组相比,PPAR y siRNA转染组中PPARγ蛋白表达水平明显下调(P<0.01); CCK-8及Annexin V/7-AAD双标结果显示：与阴性对照siRNA转染组相比,PPAR γ siRNA转染组HK-2细胞增殖被抑制(P<0.01),但细胞凋亡率不增加；而GW9662作用组中细胞增殖及凋亡均无明显变化。在GW9662 (0.5 μM)预作用1小时或PPAR γ siRNA转染后,H16R3+肖基油酸组中细胞存活率和Akt及Gsk 3β磷酸化水平降低至H16R3组水平；细胞凋亡率和凋亡相关蛋白表达水平增加至H16R3组水平。1.7 GW9662和PPAR γ siRNA废除硝基油酸对缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)引起Bax活化的抑制作用免疫荧光结果显示：在GW9662 (0.5预作用1小时或PPARγ染后,与H16R3组相比,H16R3+硝基油酸组中活化Bax的红色荧光强度仍处于较高水平。2 硝基油酸通过上调抗氧化物表达和抑制NADPH氧化酶活性改善缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)引起的肾小管上皮细胞氧化损伤2.1 硝基油酸而不是油酸减轻缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)后细胞内氧化应激损伤DCFH-DA染色结果显示,在缺糖缺氧16小时,复糖复氧4小时(H16R4)处理后,细胞内ROS水平最高(均P<0.01)。因此本实验选取缺糖缺氧16小时(H16R0)作为OGD模型条件；缺糖缺氧16小时,复糖复氧4小时(H16R4)作为OGD/R模型条件。DCFH-DA染色、DHE染色及JC-1染色结果表明,与OGD/R组相比,相应硝基油酸(1.25 μM)预作用组细胞中氧化应激水平明显下降(P<0.01),线粒体膜电位下降明显改善,而油酸预作用组中,上述指标无明显变化。2.2硝基油酸上调抗氧化物表达实时荧光定量RT-PCR和western blotting检测结果显示,与OGD组及OGD/R组相比,相应硝基油酸(1.25 μM)预作用组中HO-1、GCLM、SOD1基因及蛋白表达水平明显上调(均P<0.05)。ABTS法检测细胞总抗氧化能力结果显示,与正常对照组相比,OGD组和OGD/R组细胞内总抗氧化能力降低(均P<0.01)。而与正常对照组、OGD组和OGD/R组相比,相应硝基油酸(1.25 μM)预作用组细胞内总抗氧化能力明显升高(均P<0.05)。2.3硝基油酸上调Nrf2表达并促进其核转位实时荧光定量RT-PCR结果显示,正常氧浓度培养条件下的硝基油酸(1.25μM)作用组中Nrf2基因表达水平为乙醇对照组中的1.44+0.04倍(P<0.001)。Western blotting结果显示,与正常对照组和OGD/R组相比,相应硝基油酸(1.25μM)预作用组中Nrf2在细胞总蛋白中的表达量分别上调了5.89倍和0.97倍(均P<0.01)；在核蛋白中的表达量分别上调了2.88倍和1.18倍(均P<0.05)。2.4 Nrf2 siRNA部分废除硝基油酸介导的抗氧化物表达上调及抗氧化作用实时荧光定量RT-PCR和western blotting结果显示,与阴性对照siRNA转染组相比,Nrf2 siRNA转染组中,Nrf2基因及蛋白表达水平明显下调(均P<0.001)；在Nrf2 siRNA转染后, H16R4+硝基油酸组与H16R4组相比,HO-1及GCLM基因和蛋白表达水平无明显上调,但SOD1基因和蛋白表达水平仍被上调(P<0.05)。DCFH-DA染色、ABTS法检测细胞总抗氧化能力及JC-1染色结果表明,在Nrf2 siRNA转染后,H16R4+硝基油酸组与H16R4组相比,氧化应激水平无明显下降,总抗氧化能力无明显提高,线粒体膜电位下降无明显改善。2.5硝基油酸抑制缺糖缺氧/复糖复氧(OGD/R)诱导的NADPH氧化酶活化还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化法检测细胞内NADPH氧化酶活性结果显示,与正常对照组相比,OGD组和OGD/R组中NADPH氧化酶活性明显升高(均P<0.05)；与OGD组和OGD/R组相比,相应硝基油酸(1.25μM)预作用组中NADPH氧化酶活性下降(均P<0.05)。实时荧光定量RT-PCR和western blotting结果显示,与OGD/R组相比,相应硝基油酸(1.25 μM)预作用组中NOX4、NOX2、p22phox基因及蛋白表达水平下调(均P<0.05)。2.6 Nrf2 siRNA未影响硝基油酸介导的NADPH氧化酶上调抑制作用实时荧光定量RT-PCR结果显示,与H16R4组相比,阴性对照siRNA和Nrf2 siRNA转染后的H16R4+肖基油酸组中NOX4、NOX2、p22phox基因表达水平仍被下调(均P<0.05)。研究结论1.硝基油酸下调缺糖缺氧/复糖复氧后HK-2细胞凋亡水平；2.硝基油酸减轻缺糖缺氧/复糖复氧后HK-2细胞内氧化应激损伤；3.硝基油酸可通过PPARγ依赖的方式激活Akt/Gsk3β通路,抑制Bax活化及其线粒体转位,从而减少缺糖缺氧/复糖复氧造成的线粒体源性细胞凋亡。4.硝基油酸可上调SOD1和Nrf2依赖的HO-1＝GCLM表达水平,恢复抗氧化系统功能；抑制NADPH氧化酶激活,减少ROS生成,从而改善缺糖缺氧/复糖复氧造成的氧化应激损伤。