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目的:缺血性心脏病是一种常见疾病。在西方发达国家,缺血性心脏病,占死亡原因的第一位。在我国,缺血性心脏病发病率有上升趋势。如何防治心肌缺血是缺血性心脏病防治研究的关键问题。现阶段这方面的研究大致包括介入性治疗、外科手术治疗以及药物治疗。前两类虽可迅速解除心肌缺血,但存在手术创伤严重、缺血再灌注损伤、术后再狭窄等风险因素。这在一定程度上限制了这些治疗技术的应用和发展,故现阶段仍然以药物治疗为主。临床上应用的大多是西药,这些药物虽针对性强,但作用比较单一,易产生耐受及毒副作用等。因此,目前抗心肌缺血的中药的开发研制倍受中外学者的关注,中药具有药性温和,标本兼治,毒副作用小等优点。有文献报道许多中药具有抗心肌缺血的作用,但这些研究比较零碎,全面、深入的研究报道较为罕见。 内皮素(endothelin,ET)是由Yangisawa等从猪主动脉内皮细胞培养液中分离出的一种多肽。ET包括ET-1、ET-2和ET-3。生理条件下体内存在一套完整的ET表达和调控系统,维持基础或适应于生理水平的ET表达、释放,以旁分泌和胞内分泌方式调节循环系统功能。ET-1是迄今所知的最强的缩血管物质,由于它在动脉粥样硬化及缺血性心脏病发生、发展中起重要的作用而受到广泛重视。 有研究表明一些中药能影响机体ET的生成、释放,对缺血性心脏病的治疗有着良好的疗效。通窍活血汤是中医传统古方,对心肌缺血有明显的保护作用。本研究以ET为突破口,试图从基因水平阐明通窍活血汤抗心肌缺血的分子机制。 方法及结果: 1、垂体后叶素(pituitrin,pit)造模对血浆及心肌组织ET-1浓度的影响安徽医科大学硕士学位论文1.1、Pit对血浆及心肌组织ET一1浓度影响的量效关系 SD大鼠,随机分为六组。各剂量组按每kg体重Ou、su、zou、15u、20u、25u分为六组。ou组为对照组,其余各剂量组腹腔注射Pit。注射后lh取大鼠心肌组织和血液,用放免法测定ET一1浓度。结果显示:心肌组织ET一1浓度随Pit剂量的增加而升高,当Pit剂量达15U/Kg时,心肌组织ET一1浓度升至最高,当Pit剂量大于15U/Kg时,心肌组织ET一1浓度下降。当Pit剂量在15一ZOU/Kg范围内,血浆ET一1浓度升至最高,并维持平台期。结果提示:Pit造模的最佳剂量应为15U/Kg。1.2、Pit对血浆及心肌组织ET一1浓度影响的时效关系 SD大鼠,随机分五组:对照组及Pit注射后不同时间点组,即30‘、60‘、 90’、120‘组。对照组,腹腔注射适量生理盐水,其余以上述获得的Pit造模适宜剂量腹腔注射,按时间点取血液及心肌组织标本测定ET一1浓度。结果显示:心肌组织ET一1浓度在Pit注射后30分钟增高,注射后60分钟心肌组织ET一1浓度升至最高。血浆ET一1浓度在Pit注射后60分钟升至最高并维持到注射后90分钟。结果提示:Pit造模的最佳作用时间应为1小时。2、通窍活血汤对心肌缺血大鼠血浆及心肌组织ET一1浓度的影响2.1、通窍活血汤对心肌缺血大鼠血浆及心肌组织ET一1浓度影响的量效关系 sD大鼠,随机分为六组:对照组,通窍活血汤剂量组按每kg体重灌胃量5g、109、159、209和259,每组均灌胃4天,最后一次灌胃后1小时立即腹腔注射Pit。按上述得到的Pit作用参数终止实验,取材,分别测定血浆和心肌组织ET一1浓度。结果显示:当通窍活血汤剂量为5g/kg给药可降低心肌组织ET一1浓度,增加通窍活血汤剂量并不能增加这种降低效应。当以109/kg剂量给药可降低血浆ET一1浓度,增加通窍活血汤剂量并不能增加这种降低效应。结果提示:通窍活血汤的最佳剂量应为10g/kg。2.2、通窍活血汤对心肌缺血大鼠血浆及心肌组织ET一1浓度影响的时效观察 SD大鼠,随机分为五组:对照组,通窍活血汤按上述实验得到的最佳剂量灌安徽医科大学硕士学位论文胃,按灌胃时间的不同分为2天、4天、6天、8天,共5组。每组动物分别在最后一次灌胃后1小时立即腹腔注射Pit。按上述得到的Pit作用参数终止实验,取材,分别测定血浆和心肌组织ET一1浓度。结果显示:通窍活血汤给药4天,血浆、心肌组织ET一1浓度降低并维持到给药8天。结果提示:通窍活血汤最佳给药时间应为4天。2.3、通窍活血汤对心肌缺血大鼠血浆及心肌组织ET一1浓度的影响 SD大鼠,随机分为三组:正常对照组,缺血组、缺血加通窍活血汤组。缺血组、缺血加通窍活血汤组按上述实验提供的最佳参数造模、给药。实验终止,取材,分别测定血浆和组织ET一1浓度。结果显示:通窍活血汤能明显降低心肌缺血大鼠心肌组织、血浆ET一1浓度,使之恢复到正常水平。3、通窍活血汤对心肌缺血大鼠心肌组织ET一1影响的免疫组化研究 动物分组、处理同2.3。实验终止时取相同部位的心室、心房组织各一块。常规制片,光学显微镜下观察并随机选取5个视野进行灰度值测定。结果显示:通窍活血汤能明显降低心肌缺血大鼠心房、室肌组织ET一1浓度,使之恢复到正常水平。4、通窍活血汤对心肌缺血大鼠心肌组织ET一1基因表达的影响动物分组、Trizole reagent处理同提取总2.3。实验终止时,每只动物均取相同部位的心肌组织,用RNA,进行RT一PCR。PCR产物进