肺癌是一种在世界范围内影响人类健康的恶性肿瘤，在许多国家和地区其发病率和死亡率均为首位。据报道，Ⅰ期肺癌患者肿瘤切除后的3-5年无瘤生存率高达60％-90％，但只有不足20％的肺癌患者在确诊时属于Ⅰ期。因此各期肺癌总的5年生存率令人失望，只有不到15％。由于肺癌对全世界公共卫生的巨大影响，及早期诊断对肺癌预后的重大意义，肺癌发病机制及早期诊断的研究一直是世界范围内的重大课题。 在长期的肺癌研究中人们发现，吸烟、环境污染和职业暴露与肺癌的发生密切相关，它们可能导致一系列的致畸致突变反应的发生。分子生物学在肺癌中的应用揭示，肺癌中主要有Rb，p16，p53，Ki-ras，Her-2／neu，C-myc等基因的变化及3p，9p，13q，17p染色体的丢失和缺陷。虽然众多的研究表明这些遗传信息的改变与肺癌的发生和预后有一定的关系，但这并没有为临床诊断和治疗提供足够的信息。对肿瘤的生物学研究，使人们越来越认识到从单一正常细胞到具备浸润生长特性的肿瘤的过程实质上是一演化过程。在这一演化过程中，有众多基因参与，它们不是单一地起作用，而是在细胞调控中构成网络，相互协调。这种平衡的破坏(由于突变，表达调控的异常)是异常表形出现的原因，是肿瘤细胞演化的根本。 根据临床表现和组织学特点，肺癌基本上分为4类：1)小细胞肺癌，2)腺癌，3)鳞状细胞癌，4)大细胞癌。各种类型的肺癌其分子生物学基础均有不同，导致其不同的临床进程。其中腺癌是一类起源于小气道上皮细胞的恶性肿瘤，大约占肺癌的30％，并有逐渐上升的趋势。已证实，腺癌的发生与吸烟的关系不大，其发病年龄较小，女性多见。早期腺癌的临床表现不明显，这对于早期诊断、早期治疗非常不利。因此研究肺腺癌的发病机制，探索其新的早期诊断方法在肺癌研究中有重要意义。 基于PCR的消减杂交技术(PCR一based subtraetivehybridization)是1998年由zha。等在经典消减杂交方法的基础上经改良而创立的。基于PCR的消减杂交技术的基本原理是碱基互补、分子杂交，具体是指将实验组的cDNA和与对照组cDNA互补的扣除探针杂交，去除杂交体和未杂交上的探针，得到的为实验组独有的cDNA片段，即为差异表达的基因片段。该方法与其它研究差异表达的技术相比需要实验设备少、操作不复杂，而且可以直接获得全长cDNA，使获得功能基因的速度大大加快。该方法到目前己经应用到多种疾病的基因差异表达检测，取得了理想的研究成果。因此将该方法应用于肺癌的研究中检查肿瘤细胞的基因变化模式，筛选出差异表达基因进而研究这组基因在肺癌演化过程中的作用，是筛选肺癌早期诊断标记和分子治疗靶基因的一条捷径。 实验材料1.标本:来源于中国医科大学第一附属医院胸外科一患者的手术切除标本，切取癌组织与癌旁SCm的正常肺组织各0.SC耐置一70℃深冻冰箱中保存，切取的癌组织经病理确证为腺癌、癌旁组织中不含癌组织。2.引物:分为锚定引物和随机引物。3.主要试剂:(1) RNA提取试剂Trizol Reagent(单相裂解试剂)、总RNA分离试剂(2)逆转录试剂(3) PCR试剂(4)载体连接系统 (5)高转化细胞(6)质粒筛选试剂(7)内切酶(8)质粒抽提纯化试剂盒。4.主要仪器设备:匀浆仪、PCR仪、台式低温超速离心机、孵育箱、电泳仪等。 实验方法1.总RNA提取:取癌组织和癌旁组织用锡箔纸分别包裹后液氮冷却10分钟，锤击粉碎加入Tri 201试剂，匀浆器匀浆，经氯仿抽取离心， 2加入异丙醇混匀离心，弃去上清，乙醇漂洗后备用。2.mRNA的提取:应用聚苯乙烯磁珠法。3.反转录:实验组mRNA用锚定引物反转录;驱动组mRNA用01igodT做为引物进行普通反转录。4.扣除探针的制备:将驱动组cDNAS进行随即引物PCR扩增，其产物即为扣除探针(已经被生物素标记)。5.实验组cDNAS与扣除探针进行液相杂交。6.除去杂交体和扣除探针:向杂交液中加入链亲核素偶联磁珠悬液，分离后保留上清，即为未杂交上的实验组cDNAS，即差异片段。7.差异片段的特异性扩增:以上诉上清液为模板进行PCR扩增。8.差异片段的克隆:(l)连接:将纯化的PCR产物在T4DNA连接酶作用下与pGEM一T载体反应，4℃过夜置一20℃冰箱中保存。(2)转化:将连接反应产物中加入JM 1 09感受态细胞，加入LB培养基，离心、弃上清，接种于含氨节青霉素工PTG和X一gal的琼脂培养基平皿中，37℃过夜。(3)阳性克隆的筛选:pGEM一T质粒具有p一半乳糖普酶筛选系统，它携带一段细菌的LaCZ基因Q一肤基因，外源基因的插入使该基因失活，使其编码的p一半乳糖昔酶的一段Q一肤失去功能，不能将生色底物X一gal催化，所以含重组质粒的细菌将形成白色菌落，而非重组质粒因具有Q一肤活性，能使生色底物产生蓝色，形成蓝色菌落，若阳性对照(白色菌落)和阴性对照均正确，而插入目的cDNA的转化子在上述培养皿上面既存在蓝色又存在白色菌落的情况下，白色菌落即为阳性克隆。(4)质粒DNA的提取?