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氮素是生物体内蛋白质、核酸和一些辅因子等含氮化合物的重要组分,它的代谢作为一种重要的生命活动,广泛存在于所有的生物体中。而氨(铵离子)是被生物体吸收的最为经济有效的一种氮素形式,是生物体内氮素转运的的主要形式之一。铵离子作为氮素代谢的中心环节,是生物体内所有氮源的最终代谢产物和生物体内所需的氨基酸、核酸和辅因子等氮类化合物的生物合成的底物。生物体对环境中的NH4+的吸收和NH4+在组织间的转运,是由位于细胞原生质膜上的NH4+转运蛋白(铵载体)介导的需能主动运输过程。因此,我们在和刺糖多孢菌亲缘关系较近的天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)M145和变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)TK24中过量表达铵转运蛋白(ammonium transporter),以期改善M145和TK24的氮源环境,并进一步探讨铵转运蛋白Amt对M145和TK24代谢的影响。
本论文以刺糖多孢菌(Sacoharopolyspora spinosa)基因组为模板扩增铵转运蛋白基因(ammonium transporter gene),并对其进行测序,经过酶切、连接,并回收,将其连入pMD18-T载体中,转化大肠杆菌Top10,构建到大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pMF上,再借助接合转移,将该基因导入天蓝色链霉菌M145和变铅青链霉菌TK24中,在双向启动子PactⅠ/Ⅲ的作用下过量表达铵转运蛋白,比较转化子和野生型的表型,分析该基因的过量表达对天蓝色链霉菌M145和变铅青链霉菌TK24代谢的影响。
对原始菌株和接合子进行固体平板培养和液体摇瓶发酵培养,并进行了次生代谢产物放线紫红素产量的测定和菌体形态观察,结果发现:转化子M145/pMF-amt的Act摇瓶发酵产量是对照株M145的2.85倍,转化子TK24/pMF-amt的Act摇瓶发酵产量是对照株TK24的30.02倍,而对照菌株M145和M145/pMF、TK24和TK24/pMF之间并没有很大差别。接种R4C固体培养基,观察色素和孢子形成情况,发现转化子M145/pMF-amt和TK24/pMF-amt的产孢量高于对照株,并且色素形成的起始时间比两株对照菌都要早。
本研究首次从刺糖多孢菌中克隆了铵转运蛋白,并且在链霉菌模式菌株中进行了初步的功能研究,为后续的研究工作奠定了基础。