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脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是一种给个人、家庭及社会带来巨大医疗、心理和经济负担的突发性事件。大量的研究证明,成年哺乳动物只有外周神经可以再生,中枢神经系统(central nervous system ,CNS)不能再生。与外周神经和胚胎CNS相比,损伤轴突不能再生的主要原因是:残存成熟神经元内在的再生能力下降;CNS微环境中存在轴突生长抑制因子;胶质细胞增生形成的瘢痕阻碍轴突生长。近年来研究证明,当提供适当的条件后CNS能够再生,而且这些轴突的再生是由中枢神经元固有特性(intrinsic properties)和所处的环境决定的。然而许多措施虽然可以促进轴突出芽,但由于胶质细胞形成的胶质瘢痕和抑制因子阻碍了神经的生长,再生轴突中的大部分围绕细胞或组织移植区生长,很少有神经纤维跨越损伤区而进入远端,要建立功能性轴突联系更加困难。如果能够应用药物进行干预,将是一种简单易行的方法。目前临床应用甲基强的松龙(mythylprednisolone, MP)、治疗性疫苗(therapeutic vaccination)等药物来改变神经元内在的再生状态,提高cAMP,失活Rho。有资料显示,没有足够的证据表明MP对急性SCI有明显的治疗作用。在成年大鼠CNS的局部应用神经营养因子(NTF)能提高损伤神经元存活和损伤轴突的生长,但NTF家族其分子量大,很难透过血脑屏障,并且经过酶的降解作用使其对神经元保护作用和轴突的生长作用大大受限。因此寻求一种能够通过血脑屏障且不易降解、无毒、具有类似NTF作用的药物是非常重要的。丙戊酸(valproic acid,VPA)是一种分子量很小的短链脂肪酸,具有迅速穿过BBB的特性。它作为抗癫痫和抗惊厥的一线药物,已在临床应用近40年。最近的研究发现,VPA在大脑和体外细胞培养中具有保护、营养和抑制神经元凋亡的作用;能够对抗脂多糖产生的神经毒作用;使培养中的细胞内氧化作用降低;降低炎症因子的水平,保护多巴胺神经元,减少星形胶质细胞和小胶质细胞的增生;能够使哺乳动物神经元生长锥膨大,防止塌陷,从而促进神经生长;对损伤后的外周神经有明显促进生长的作用,并加速其髓鞘化。促进培养中的脑源性神经干细胞(neural stem cells,NSCs)向神经元分化,对于大鼠NSCs培养分化后,其促进神经生长的效果优于BDNF和NT3。关于VPA对SCI的研究很少,它能否保护脊髓神经元;促进残存神经元轴突生长;抑制神经胶质细胞增生?本研究的目的是观察VPA对大鼠SCI后的修复作用,并对其机制进行研究,为临床SCI提供治疗策略,同时对SCI后呼吸系统并发症的原因进行初步的探索。主要方法及技术路线实验分为四个部分1.采用孕13-16天的Wistar胎鼠脊髓组织,在体外用NB(Neural basal medium,NB)培养液进行NSCs培养,采用Nestin进行免疫荧光鉴定NSCs。在分化时加入含有浓度为1.0mM VPA的培养基,分化后用GFAP和NF-200进行免疫荧光双标,观察VPA对NSCs分化的影响。2.制备Wistar大鼠T10脊髓平面的Allen’s打击损伤模型,打击力度为25 g·cm。实验动物分为对照组(A组);单纯损伤组(B组);损伤后MP治疗组(C组)和损伤后VPA治疗组(D组);C组于损伤后半小时内首次按30mg/kg,随后按5.4mg/kg/h给予MP,每1小时给药一次,连续给23次;D组于损伤后半小时经腹腔按300mg/kg/d,分两次给药;B组同D组一样每日给予等量的生理盐水,观察8w。采用BBB评分、神经电生理和BDA神经顺行示踪技术,评价VPA对SCI后的神经修复作用。3.建立大鼠Allen’s打击损伤模型,将动物分为对照组(A组)、单纯损伤组(B组)和VPA治疗组(C组)。每个组又按不同时相点分为1d,3d,1w,2w,4w,通过病理学、TUNEL技术和电子显微镜观察VPA对SCI后神经细胞的保护作用;应用Nestin免疫组化染色,Brdu与NF-200免疫荧光双标,观察VPA对内源性NSCs的作用;采用Brdu免疫组化和GFAP与NF-200免疫荧光双标,观察VPA对神经元的保护作用和对星形胶质细胞增殖的影响;4.制备Wistar大鼠T10脊髓平面的Allen’s打击损伤模型,打击力度为25 g·cm。将动物分为对照组(A组)和实验组(B组)。A组只切除椎板组,B组为SCI。每个组又按照不同时相点分为1d,3d,1w,2w,4w。取肺组织,通过大体标本和病理学观察SCI后肺组织形态学变化;并通过湿干重之比(W/D)测定肺组织水肿程度。主要结果及结论:1.在脊髓源性NSCs的培养中,加入含有浓度为1.0mM VPA的血清培养基2w,与对照组比较,分化成神经元的数目明显比对照组多(p<0.01),而星形胶质细胞的比例比对照组少(p<0.01)。表明VPA能够促进脊髓源性NSCs向神经元分化,抑制NSCs向星形胶质细胞分化。2.大鼠SCI后,A组8w时BBB评分为21分;而B组8w时为17.46±1.98;C组为17.53±1.76;D组为19.87±1.89(p<0.05)。8w时,B组MEP潜伏时为11.06±1.18;C组为10.88±1.42;而D组为8.90±0.80(p<0.05)。B组SEP潜伏时为15.75±1.04;C组为15.09±1.32;而D组为13.25±0.89 (p<0.05)。BDA神经示踪显示:8w时DBA标记到的皮质脊髓束A组为32.23±3.21;B组为17.52±3.98;C组为18.09±4.21;D组为25.26±4.84(p<0.05)。上述结果表明VPA对大鼠SCI后的神经修复有一定的促进作用。而MP对大鼠SCI后的功能恢复没有明显作用(p>0.05)。3.大鼠SCI后3d,TUNEL阳性细胞数目达到高峰,C组凋亡指数为25.24±4.05;B组凋亡指数38.21±4.55;明显高于C组(p<0.05),随后开始下降。电子显微镜扫描结果显示:神经元胞核染色质边集,胞核增大,出现凋亡小体的细胞在B组较C组多。结果表明:VPA能够抑制神经元凋亡,这可能是SCI后VPA促进神经功能恢复的主要原因之一。4.大鼠SCI后24h, B组Nestin表达与C组无显著差异;1w时C组在中央管周围Nestin阳性细胞明显较B组多(p<0.05),持续至4w时仍高表达。B组4w时Nestin表达明显下降,8w时很少或几乎无表达(p<0.05)。中央管周围许多Nestin阳性表达的细胞证明:大鼠SCI后,损伤启动某些细胞表达Nestin。Brdu与NF-200免疫荧光双标显示:中央管周围发现Brdu与NF-200共表达的阳性细胞证明,SCI能够诱导脊髓发育和再生。结果表明:SCI能够激活内源性NSCs,而VPA能够进一步促进NSCs的增殖,并可能促进其向神经元分化。这可能是VPA促进神经功能恢复的另一个原因。5.大鼠SCI后3d,C组和B组灰质中Brdu阳性细胞都增多,但B组较C组明显多。1w时阳性细胞数量达到高峰,B组多于C组(p<0.05)。4w时两组阳性数目都很少,在统计学上无显著差异(p>0.05)。4w时GFAP与NF-200免疫荧光双标显示,B组神经元数目明显减少,后角几乎没有。星形胶质细胞很多,且杂乱排列。C组神经神经元数目较B组多(p<0.05),而星形胶质细胞数目相对较少(p<0.05)。结果表明:大鼠SCI后,VPA能够抑制损伤脊髓星形胶质细胞增殖,减轻胶质瘢痕的增生。为再生轴突的穿越奠定了基础。6.大鼠SCI后,大体标本观察到,12h肺部出现出血和水肿,3d最为严重,1w开始缓解,4w基本恢复正常。镜下:实验组于6h出现散在肺泡毛细血管充血,12h肺泡毛细血管有少量出血,3d时出血、水肿达到高峰,1w缓解。损伤后24h,损伤组肺湿干重之比明显较对照组高(p<0.05);3天时最为显著(p<0.01)。结果表明:大鼠SCI后肺组织出现不同程度的出血、水肿;肺部出血和水肿可能是早期出现呼吸功能衰竭的病理基础,也是大鼠早期死亡的主要原因。SCI的五步治疗方案没有注意到并发症的预防和治疗。肺部的变化提示,在抢救急性SCI病人时,应注意呼吸功能变化。