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膜蛋白在细胞中承担着物质运输、能量转换和信号转导等重大功能,在生命活动中具有极其重要的意义.研究膜蛋白的三维结构对了解其功能和作用机制是至关重要的.所有已知序列的基因约1/4~1/3编码膜蛋白(Stahlberga et al.,2001).然而,截至2003年11月份为止,蛋白数据库中仅有不到100个膜蛋白的原子分辨率的结构,而水溶性蛋白的结构却有2万多个.蛋白质电子晶体学是研究膜蛋白三维结构的重要手段.该文建立了膜蛋白电子晶体学实验系统.从一种植物病原菌中分离纯化鉴定了一个OmpA家族的外膜蛋白(Omp37),进行了Omp37二维晶体生长的初步探索,并克隆表达了Omp37的N端部分.以黄瓜的捕光色素复合物Ⅱ(LHC-Ⅱ)为材料,建立了膜蛋白电子晶体学实验系统.包括:用Batch法进行黄瓜LHC-Ⅱ二维晶体的生长,电子显微镜载网上样品支持膜的制备,电子显微术,光学衍射装置(Optical bench)的搭建以及图像处理.从一种植物的病原菌——黄单胞菌属甘蓝黑腐病甘蓝致病变种(Xanthomonas campestris pv. campestris)分离纯化出一种主要的外膜蛋白(Omp37).通过串联质谱测序、序列比较、二级结构预测、二级结构测定、温度敏感性研究、蛋白酶酶解及功能重组等研究确定了Omp37是一个OmpA家族的蛋白.目前还没有OmpA家族中任何一个蛋白全蛋白结构的报道.为了用蛋白质电子晶体学的方法解析Omp37全蛋白的结构,进行了Omp37全蛋白二维晶体生长的初步探索.研究了蛋白状态、脂的种类和制备方法、脂蛋白比(LPR)、pH、去污剂、离子强度、温度、MgCl<,2>、甘油等因素对生长二维晶体的影响.尝试以500多个实验条件,发现了在较低LPR(0.1~1.0)下把Omp37重组到脂质体上得到较大脂蛋白体(~1μm)的条件.膜蛋白的克隆表达有较大的难度.为了增加获得二维结晶的可能性,探索了Omp37 N端部分,即膜区部分(Omp37<,191>)的克隆表达.扩增并克隆了不带信号肽序列的Omp37<,191>的基因片段.克隆化基因构建到表达载体pBAD/gⅢ中,导入E.coli Top10菌株,进行功能表达.但只得到了包括基因Ⅲ编码的信号肽、Omp37<,191>、myc epitope和组氨酸标签的融合蛋白的包含体.调控诱导温度诱导剂浓度都未能获得显著量的正确折叠蛋白.由于该融合蛋白带有信号肽,不利于包含体的复性.因此,将克隆化目的基因构建到表达载体pET22b(+)中,导入E.coli BL21菌株,进行非功能表达,获得了带组氨酸标签的Omp37<,191>的包含体.