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目的：骨质疏松症严重危害着人类健康，其特征是骨吸收和骨形成失衡引起的骨量减少。骨平衡主要取决于成骨细胞导致的骨形成与破骨细胞导致的骨吸收。间充质干细胞是脂肪细胞、成肌细胞的祖细胞，可以分化为成骨细胞。间充质干细胞向成骨分化的减少是导致骨质疏松的重要原因。许多研究表明，骨形态发生蛋白(BMPs)和转化生长因子(TGF-β)是影响成骨细胞分化的最重要因子。BMP-2是在成骨细胞的分化过程中的一个关键的信号分子，是TGF-β超家族的一员。Smad5是下游转录因子，可以被BMP-2受体激活。磷酸化的Smad5与Smad4形成复合物，然后转移到细胞核内，激活转录因子Cbfa1/Runx2。BMP-2和Smad5信号转导通路是成骨分化过程中的重要信号通路。MicroRNAs(miRNAs)是小的非编码单链RNAs，总长度在18-25个核苷酸。一般来说，miRNA能通过结合靶基因的3非编码区(3 UTRs)抑制其翻译或促进其mRNA降解，从而抑制靶基因。miRNA在许多生物过程中都是必不可少的，包括细胞增殖、分化、凋亡以及肿瘤的发生。大量研究表明，miRNAs在成骨细胞分化过程中发挥着重要的作用。例如，miR-133和mir-135通过影响骨形成的多条信号转导通路从而抑制骨分化，包括Runx2和Smad5。研究表明，miR-214和miR-145可以通过靶向Osterix，抑制成骨细胞的分化。mir-302a通过抑制COUP-TFII促进成骨细胞分化miR-338-3P被证实通过靶向Runx2和FGFR2抑制成骨分化。最近研究发现，miR-135可以靶向结合Smad5抑制成骨分化。然而，对于调节Smad5表达的miRNAs仍需要我们进一步的研究。 方法：⑴在成骨分化的过程中，miR-106b-5p和miR-17-5p的表达量显著下调。我们采用实时荧光定量PCR的方法，首先检测了mir-106b-5p和miR-17-5p在成骨细胞分化过程中的表达。采用C2C12和MC3T3-E1细胞作为细胞模型。为了诱导C2C12细胞成骨分化，培养基用无血清DMEM和300 ng/ml BMP-2取代正常培养基。为了诱导MC3T3-E1细胞向成骨分化，培养基用无血清α-MEM和300 ng/mlBMP-2取代正常培养基。然后我们检测了与成骨分化密切相关的表型标记物的表达，包括Runx2、ALP和OC。⑵miR-106b-5p和miR-17-5p能抑制成骨分化。我们还检测了mir-106b-5p和miR-17-5p相应的模拟物和抑制剂对成骨分化的影响。将mir-106b-5p和miR-17-5p模拟物/抑制剂和阴性对照转染到C2C12细胞中。采用实时荧光定量PCR检测miRNAs模拟物/抑制剂的干扰效率和Runx2、ALP和OC的表达。我们用western-blot法检查Runx2蛋白的表达，用碱性磷酸酶染色和茜素红染色检测C2C12细胞的成骨分化。⑶miR-106b-5p和miR-17-5p靶向结合Smad5。我们通过生物信息学软件Targetscan6.2和microRNA.org预测miR-106b-5p和miR-17-5p的靶基因。预测结果显示Smad5作为mir-106b-5p和miR-17-5p的靶基因。因此，我们进行了荧光素酶活性验证，共转染野生型小鼠3 UTR荧光素酶报告基因质粒(WT)和突变型质粒(MUT)与mir-106b-5p和miR-17-5p模拟物/抑制剂，转到C2C12和MC3T3-E1细胞中，检测荧光素酶活性得改变。为了验证miR-106b-5p和miR-17-5p靶向结合于Smad5，我们将miR-106b-5p和miR-17-5p转染到小鼠C2C12细胞中，Western blot检测Smad5蛋白的表达。⑷miR-106b-5p和miR-17-5p通过靶向结合Smad5抑制成骨分化。为了进一步验证mir-106b-5p和miR-17-5p通过靶向结合Smad5抑制成骨细胞分化。我们用Smad5特异性的siRNA抑制其表达，实时荧光定量PCR和Western blot检测siRNA的抑制作用。并且将siSmad5和mir-106b-5p和miR-17-5p的inhibitors共同转染到C2C12细胞中，qRT-PCR检测成骨分化基因的表达。⑸mir-106b-5p和miR-17-5p能够调节体内骨形成。为了探索在体内miR-106b-5p和miR-17-5p的作用，建立了卵巢切除的小鼠骨质疏松动物模型，我们将化学修饰的特异性mir-106b-5p和miR-17-5p（antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p）(80mg/kg)以及阴性对照、PBS注射到小鼠体内。当连续注射3天antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p后，qRT-PCR检测骨组织中mir-106b-5p和miR-17-5p水平。为了保持mir-106b-5p和miR-17-5p的水平，这些小鼠在第一次注射后第四周的1到3天连续注射antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p以及阴性对照、PBS。干预6周后处死所有小鼠，进行分析。采用双能X线骨密度仪(DXA)测定骨密度。我们用显微CT分析骨体积分数(BV/TV)和骨小梁数目(TB.n)，骨小梁厚度(TB.Th)，骨小梁间距(TB.SP)。我们用实时定量PCR检测成骨细胞活性的标志物如Runx2、ALP、OC和Smad5以及小鼠血清B-ALP。 结果：①在成骨分化的过程中，miR-106b-5p和miR-17-5p的表达量显著下调。用BMP-2诱导C2C12细胞和MC33-E1细胞成骨分化后，我们发现成骨分化基因Runx2、ALP和OC的mRNA水平明显上调。上述结果表明，我们已经成功地诱导成骨分化。与此同时，与对照组相比，BMP-2诱导组mir-106b-5p和miR-17-5p的表达量显著下调。我们的研究表明，miR-106b-5p和miR-17-5p可能对成骨分化起到重要的调控作用。②miR-106b-5p和miR-17-5p能抑制成骨分化。miR-106b-5p和miR-17-5p模拟物/抑制剂和阴性对照转染到C2C12细胞后48 h，我们验证了miRNA模拟物/抑制剂的干扰效率。转染mir-106b-5p和miR-17-5p抑制剂到C2C12细胞中，24 h无血清培养后，我们用qRT-PCR检测Runx2、ALP和OC的表达，发现这些基因的mRNA表达显著上调。相反，C2C12细胞中转染mir-106b-5p和miR-17-5p模拟物，结果显示成骨分化基因mRNA的表达水平显著下调。同样，C2C12细胞中转染miR-106b-5p和miR-17-5p抑制剂后Runx2蛋白表达显著增加，转染其模拟物后Runx2蛋白表达显著下降。在诱导分化7d后，与对照组相比，ALP染色结果显示在mir-106b-5p和miR-17-5p模拟物组的蓝色明显变浅，而mir-106b-5p和miR-17-5p抑制剂组的蓝色则明显深。在诱导分化14d后，茜素红染色结果显示，基质矿化水平得到相似的结果。我们的数据表明，mir-106b-5p和miR-17-5p能抑制成骨细胞分化。③miR-106b-5p和miR-17-5p靶向结合Smad5。mir-106b-5p、miR-17-5p和Smad5质粒共转染到C2C12和MC3T3-E1两个细胞系中，Smad5野生型组(WT)显示出明显抑制荧光素酶活性，而突变组(Mut)没有显示出荧光素酶活性的改变。我们发现，在C2C12细胞中过表达miR-106b-5p和miR-17-5p，会明显抑制Smad5蛋白水平，而mir-106b-5p和miR-17-5p抑制组， Smad5蛋白表达增加。这些数据表明，mir-106b-5p和miR-17-5p可能抑制基因Smad5的表达。④miR-106b-5p和miR-17-5p通过靶向结合Smad5抑制成骨分化。跟预期结果相同，转染siRNA到C2C12细胞中显示出Smad5的表达量明显下降，表明siSmad5干扰Smad5表达成功。然后我们分别将miR-106b-5p和miR-17-5p的抑制剂及siSmad5转染到C2C12细胞中，发现siSmad5可以将mir-106b-5p和miR-17-5p抑制成骨分化的作用明显逆转。我们的数据表明，mir-106b-5p和miR-17-5p靶向结合Smad5基因，从而抑制C2C12细胞成骨分化。⑤mir-106b-5p和miR-17-5p能够调节体内骨形成。当在小鼠体内注射连续antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p3天后，qRT-PCR显示骨组织中mir-106b-5p和miR-17-5p的表达量明显下降。相反，antagomir NC和PBS组中mir-106b-5p和miR-17-5p表达量没有发生改变。这些数据表明，antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p能有效抑制骨组织中mir-106b-5p和miR-17-5p表达。骨密度测量结果表明，在假手术组，antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p干预的小鼠股骨表现出明显的骨密度(BMD)增加。去卵巢组的小鼠表现出股骨骨密度的降低。antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p干预去卵巢小鼠组具有最小的骨密度。microCT数据的定量分析显示，无论在假手术组还是在去卵巢组，antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p治疗组的小鼠骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数目(TB.n)和骨小梁厚度(TB.Th)显著上调，骨小梁间距(TB.SP)变小。这些数据表明，antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p参与骨代谢的调节。骨组织的检测结果显示，antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p干预小鼠，能增加成骨细胞活性的标志物如Runx2、ALP、OC在骨组织中的表达。与此同时，antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p干预组也增加Smad5（靶基因）在骨组织中的表达水平;同样，血清中ALP水平也升高。这些结果表明antagomir-106b-5p和antagomir-17-5p可通过促进骨形成增加骨量。 结论：⑴在成骨分化的过程中，miR-106b-5p和miR-17-5p的表达量显著下调。⑵miR-106b-5p和miR-17-5p能抑制成骨分化。⑶miR-106b-5p和miR-17-5p靶向结合Smad5。⑷miR-106b-5p和miR-17-5p通过靶向结合Smad5抑制成骨分化。⑸mir-106b-5p和miR-17-5p能够调节体内骨形成。我们的结果表明，mir-106b-5p和miR-17-5p可能通过靶向结合Smad5基因抑制成骨分化和抑制体内骨形成。这揭示了miRNA对成骨分化和骨形成新的作用，可能为治疗骨质疏松症提供新的方法。