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PRR11(Proline-rich11)及其上游邻接基因FAM33A(Family with sequencesimilarity33,member A)是两个最近由我们以及Nigg研究小组分别发现的参与细胞增殖和细胞周期调控的肿瘤相关新基因。两者以独特的“头对头”方式紧密排列于17q23区,组成一个典型的受双向启动子调控的基因转录单元。此前我们已经对该PRR11-FAM33A双向启动子进行了较为系统的分析和鉴定,并初步将其核心区域缩短定位于一80bp的范围内。本研究将在这一基础上,进一步对PRR11-FAM33A双向启动子核心区域重要的顺式作用元件进行分析,并进一步重点分析p53与NF-Y对PRR11-FAM33A双向启动子的转录调控作用。(1)PRR11-FAM33A双向启动子核心区域的重要转录因子结合位点分析采用TFSEARCH等多种软件,对PRR11-FAM33A双向启动子核心区域的潜在转录因子结合位点进行分析。同时,采用BLAST软件对其序列同源性进行分析。结果表明,PRR11-FAM33A双向启动子核心区域存在典型的NF-Y、Sp1和Myb结合位点,且这些结合位点的序列在人、大鼠和小鼠等多个物种中高度保守,强烈提示其在PRR11-FAM33A双向启动子的转录调控中起重要作用。(2)PRR11-FAM33A双向启动子核心区域的定点突变分析为了进一步确认上述生物信息学的分析结果,我们对PRR11-FAM33A双向启动子核心区域进行了定点突变分析。首先,采用基因定点突变技术,以前期构建的启动子荧光素酶报告基因重组体PRR11-P80和FAM33A-P80为模板,对上述发现的PRR11-FAM33A双向启动子核心区域包含的NF-Y、Sp1和Myb结合位点进行定点突变,构建了一系列的定点突变重组体。然后,采用双荧光素酶报告基因分析系统对各重组体的启动子活性进行检测。结果表明,与野生型的报告基因重组体PRR11-P80和FAM33A-P80相比,NF-Y、Sp1和Myb结合位点的定点突变重组体的启动子活性均显著降低,这进一步强烈提示NF-Y、Sp1和Myb在PRR11-FAM33A双向启动子的转录调控中起重要作用。(3)NF-Y直接调节PRR11-FAM33A双向启动子的转录首先,将前期构建的各PRR11-FAM33A双向启动子报告基因系列删除体、NF-Y结合位点定点突变重组体分别单独转染或与NF-Y真核表达质粒共转染入H1299细胞,结果表明,NF-Y过表达能够明显提高包括PRR11-P80和FAM33A-P80在内的各个系列删除体的活性,但NF-Y过表达对NF-Y结合位点的定点突变重组体的启动子活性的上调作用受到显著削弱甚至丧失,提示NF-Y主要通过PRR11-FAM33A双向启动子核心区域中的NF-Y结合位点(CCAAT盒)发挥对PRR11-FAM33A转录单元的直接转录激活作用。同时,将NF-YB siRNA转染入H1299细胞,定量RT-PCR分析结果表明,siRNA介导的NF-Y表达抑制可导致细胞内源性的PRR11和FAM33A mRNA水平降低。另外,染色质免疫沉淀分析(Chromatin immunoprecipitation assay, ChIP)和电泳迁移率变动分析(Electrophoretic mobolity shift assay,EMSA)实验结果也证实,NF-Y可以在体内(in vivo)和体外(in vitro)结合在PRR11-FAM33A双向启动子核心区域的NF-Y结合位点。这些结果表明,NF-Y可以直接调节PRR11-FAM33A双向启动子的转录,PRR11和FAM33A是两个新的NF-Y靶基因。(4)p53通过NF-Y抑制PRR11和FAM33A的转录首先,将前期构建的PRR11-FAM33A双向启动子报告基因重组体单独转染或与野生型p53表达质粒、突变型p53表达质粒和NF-Y表达质粒以不同组合共转染H1299细胞。启动子活性分析结果表明,野生型p53过表达能够明显抑制PRR11-FAM33A双向启动子的活性,而突变型p53过表达对该双向启动子没有抑制作用。与NF-Y转染组相比,NF-Y和野生型p53共转染组的启动子活性明显降低,表明p53可以抑制NF-Y对PRR11-FAM33A双向启动子的激活作用。但与野生型的报告基因重组体PRR11-P80和FAM33A-P80相比,野生型p53过表达对NF-Y结合位点的定点突变重组体的启动子活性的抑制作用受到显著削弱甚至丧失,表明p53通过NF-Y而发挥其对PRR11-FAM33A的转录抑制作用。同时,将NF-YB siRNA与野生型p53表达质粒单独或联合转染入H1299细胞,定量RT-PCR分析结果表明,野生型p53表达可以导致细胞内源性PRR11和FAM33AmRNA水平降低,且NF-Y的表达被抑制之后,p53下调内源性PRR11和FAM33A基因mRNA表达水平的能力明显减弱。免疫共沉淀结果表明,p53与NF-Y在细胞内具有相互作用并形成复合物。ChIP实验结果显示,外源过表达p53时,p53在细胞内结合在PRR11-FAM33A双向启动子区域的量明显增加,并导致NF-Y在双向启动子区的结合量显著降低。这些结果强烈提示,p53能够通过与NF-Y相互作用并降低NF-Y在PRR11-FAM33A双向启动子区域的结合量而间接地抑制PRR11-FAM33A双向启动子的转录。综上,本研究不仅发现了PRR11-FAM33A双向启动子核心区域含有NF-Y等重要的转录因子结合位点,而且证实了NF-Y可以直接激活PRR11-FAM33A双向启动子的转录,且野生型p53可通过与NF-Y相互作用而间接抑制PRR11-FAM33A双向启动子的转录。本研究为进一步深入研究PRR11-FAM33A双向启动子转录调控单元在细胞周期和肿瘤发生发展的协同调控机制和分子行为机制奠定了坚实的基础,对于丰富真核生物转录调控理论尤其是真核基因双向启动子转录调控理论以及分子肿瘤学理论也均具有重要科学意义。