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体细胞核移植的成功在理论上证明了哺乳动物的分化细胞仍具有全能性，同时也为快速扩增濒危灭绝动物等提供了新途径。克隆动物的核移植受众多因素影响，其中供体细胞核的获得是重要的环节之一。目前运用细胞质内注射法进行核移植时，供体细胞必须完全破膜，因而有必要寻求一种简便可行的方法。本研究旨在以牛脾脏细胞为抗原，制备兔抗牛脾脏细胞多克隆抗体，通过免疫外科法裂解供体细胞膜，获得破膜的核胞体，进而应用于体细胞核移植的胞质内注射，从而为体细胞核移植供体细胞核的获得提供一种新的思路。主要研究内容如下：
⑴比较国产激素(FSH，LH)不同添加量对牛卵母细胞体外成熟的影响。结果表明，国产激素完全可以满足牛卵母细胞体外成熟的需要。当FSH与LH的剂量分别为10μg/mL和20μg/mL时，卵母细胞的成熟率达到最高值82.1%；这表明，牛卵母细胞体外成熟的最佳激素添加剂量组合为FSH:10μg/mL，LH:20μg/mL。
⑵牛卵母细胞在成熟培养液中添加10%的BFF，比较BFF存在与否对卵母细胞成熟的影响。结果表明，添加与不添加BFF的成熟率(83.2% versus82.1%)差异不显著。
⑶成熟培养的牛卵母细胞用ionomycin+6-DMAP±CB和乙醇+6-DMAP±CB进行激活处理，比较孤雌发育效果。结果表明：在ionomycin+6-DMAP±CB处理组中，两组之间的孤雌激活卵裂率(83.3% versus79.0%)和囊胚率(37.3% versus35.9%)都没有显著差异；而在乙醇+6-DMAP±CB处理组中，两组之间的卵裂率(82.1% versus67.5%)和囊胚率(36.2%versus25.0%)都存在显著性差异。但ionomycin+6-DMAP+CB和乙醇+6-DMAP+CB在卵裂率(83.3% versus82.1%)和囊胚率(37.3% versus36.2%)上却没有显著性差异。这表明，ionomycin+6-DMAP±CB以及乙醇+6-DMAP±CB都可以有效地激活牛卵母细胞。
⑷激活后的卵母细胞在SOFaa液中继续培养，比较换液与不换液处理对牛孤雌激活囊胚率的影响。结果表明：更换与不更换培养液在孤雌囊胚率之间(39.7% versus33.9%)没有显著性差异。这表明，牛卵母细胞孤雌激活胚在大体积(500μL)的发育液中进行发育培养时，换液与不换液对囊胚率并不会产生很大的影响。
⑸将成熟培养后的卵丘卵母细胞复合体去卵丘，然后收集所得颗粒细胞进行原代培养的方法简单易行，污染几率小，而且原代培养所需时间短，是颗粒细胞原代培养的理想方法。牛耳皮肤成纤维细胞经液氮超低温冷冻，采用快速解冻法(38℃，1～2 min)进行解冻处理，细胞贴壁情况较好。以DMSO为冷冻保护剂，手工分段降温冷冻法对牛颗粒细胞以及耳皮肤成纤维细胞的冷冻保存是切实可行的。
⑹第10代对数生长期牛颗粒细胞中期相染色体组型分析表明，体外培养的牛颗粒细胞传至第10代时，染色体为正常二倍体的比例为75.56%，可用于核移植重构胚的构建。
⑺以牛脾脏细胞为抗原，兔耳静脉注射进行免疫，制备兔抗牛脾脏细胞多克隆抗体，抗血清效价测定结果显示，血清抗体效价达到预期要求，稀释比例达到1/64时，红细胞仍有溶解反应。将兔抗牛脾细胞多克隆抗体与供体细胞反应，结果显示，抗血清可以成功的裂解供体细胞而获得核胞体，这表明，免疫外科法裂解供体细胞膜获得核胞体是切实可行的。
⑻分别以分离培养的牛颗粒细胞和耳成纤维细胞作为供核细胞进行核移植，比较不同核供体细胞对核移植效果的影响。结果发现，颗粒细胞与耳成纤维细胞构建的重构胚48h的卵裂率分别为62.62%和67.89%，没有显著差异，囊胚率(23.88% versus18.92%)也无显著差异。这说明颗粒细胞和耳成纤维细胞都可以成功地构建牛体细胞克隆胚。
⑼分别以牛颗粒细胞和耳成纤维细胞为供体细胞，探讨低温冷藏供体细胞一定时间对核移植效果的影响。结果表明：颗粒细胞是否经4℃低温冷藏处理，克隆胚的卵裂率(63.34%versus62.03%)和囊胚率(26.67% versus24.45%)都没有显著性差异；同样，耳成纤维细胞是否经4℃低温冷藏，卵裂率(70.76% versus66.67%)和囊胚率(21.74% versus19.56%)也没有显著性差异。而且，颗粒细胞和耳成纤维细胞经4℃低温冷藏处理后，卵裂率(63.34% versus70.76%)和囊胚率(26.67% versus21.74%)均不存在显著性差异。
⑽分别选择在注核后1～3 h和3～5 h进行激活处理，比较注核后不同间隔时间激活对体细胞核移植重构胚的卵裂与体外发育的影响。结果发现，颗粒细胞构建的克隆胚在注核后3～5 h进行激活较1～3 h有更高的卵裂率(73.91% versus56.52%)，表现出显著性差异，囊胚率(23.53%versus15.38%)没有显著性差异。这表明，注核后3～5 h再进行激活，可能使得供体核很好的进行重编程，进而影响胚胎的后续发育。