研究背景:糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者最常见、最严重的微血管并发症之一。DN的发病机制目前非常复杂,近年来有相关研究发现,内皮细胞功能障碍会促进DN的发展。内皮细胞间质转化(Endothelial-mesenchymal transition,EndMT)过程中产生的成纤维细胞是肾成纤维细胞的主要来源之一,后者在肾纤维化的过程中发挥着很大的作用,而肾脏纤维化是DN的主要病理表现。炎症因子、高糖等能够促进内皮细胞产生EndMT,从而逐步引起所有肾脏细胞纤维化,最终使肾脏失去功能。因此,EndMT在肾脏纤维化过程中起到至关重要的作用,是内皮细胞损伤-纤维化的重要原因和转归。EndMT在发生的时候,内皮细胞会失去特异性的标志物。例如血管内皮细胞钙黏蛋白(vascularendothelialcadherin,VE-cadherin),从而重新获得了间充质细胞的特异性标志,例如波形蛋白(vimentin)、α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscleactin,α-SMA)等等。尽管目前发现,EndMT可能是导致肾纤维化的重要机制,但其具体调控尚未清楚。与此同时,内皮细胞损伤纤维化会涉及到众多的分子信号通路,其中Wnt/β-catenin可以进行调节参与纤维化进展,此信号通路在肾脏纤维化中的角色地位已经得到了许多研究学者的证实。并且有相关研究证明了 Wnt/β-catenin信号通路途径和肾脏EMT发生有关系,而EndMT实际上就是EMT的一种特殊类型,所以这个角度出发,探索EndMT的调控机制对防治DN是一个新的方向。中医药制剂肾康丸在一定程度可改善DN,延缓DN进展,但目前并无研究表明肾康丸是否能阻断EndMT从而更好地治疗DN。因而,本实验使用肾康丸来干预DN纤维化小鼠观察EndMT及Wnt/β-catenin信号通路相关指标表达情况,初步探讨肾康丸对糖尿病肾病纤维化EndMT的干预疗效和初步机制。研究目的:观察肾康丸对DN小鼠肾纤维化的疗效进展,研究肾康丸对EndMT相关表达蛋白的影响及探讨Wnt/β-catenin信号通路在EndMT和促使肾纤维化过程中的作用,以及肾康丸是否能够抑制Wnt/β-catenin信号通路,减轻EndMT,对肾纤维化起到治疗作用,探索可能机制。研究方法:1、动物分组与造模:选择7-8周龄的C57小鼠喂养,待小鼠完全适应了外周环境,排除环境干扰,按随机分组的方法,抽样分为正常对照组、DN模型组、中药高中低干预组、厄贝沙坦对照组进行实验。每组分10只小鼠,除正常对照组外其余小鼠进行DN造模,利用STZ建立小鼠糖尿病模型,将STZ溶解于O.1mol·L-1柠檬酸钠缓冲液(pH4.5)中。向小鼠右侧腹腔中一次性注射STZ(37.5mg·kg-1),若血糖值高于16.7 mol·L-1、尿量明显增加,则造模成功,计算成模率。造模后分别灌胃给药治疗8周。治疗期间及治疗后观察小鼠一般状况、血糖、体重。2、末次给药后将小鼠放入代谢笼中,计24h尿量。然后将小鼠用苯巴比妥钠按照250mg/kg进行腹腔注射麻醉,眼眶采血,分离血清,检测小鼠24h尿白蛋白量、血肌酐、尿素氮、内生肌酐清除率等数值情况3、HE、MASSON染色观察组织糖尿病肾脏病理和纤维化程度,观察每组之间的病理变化。4、使用免疫组化、蛋白质印迹法(Westernblot,WB)检测观察标记物α-sma、vimentin、VE-cadheri在组织中的蛋白表达量。5、RT-PCR、WB 检测 Wnt1、β-catenin、P-GSK-3β的 mRNA 和蛋白表达,各组之间进行比较。结果:1、50只小鼠用于造模,成模率92.0%(46/50),成模后病死率8.6%(4/46)。在治疗期间的8周里,模型组小鼠血糖均维持在16.7mmol·L-1以上,表现出多饮、多食、多尿、消瘦的症状;与模型组相比,肾康丸组和厄贝沙坦组的血糖有不同程度的下降,差异具有统计学意义(P<0.05)。与正常小鼠相比,模型组24h尿蛋白定量明显高于正常组,具有统计学意义(P<0.05),肾康丸中、高剂量组24h尿蛋白定量明显低于模型组,具有统计学意义(P<0.05);模型组与正常组比较,BUN、Scr明显升高,Ccr显著下降,有统计学意义(P<0.05);肾康丸中、高剂量组与模型组比较,BUN、Scr显著降低,Ccr明显升高,具有统计学意义(P<0.05)。2、HE染色提示正常组的肾脏组织表现正常,系膜基质分布未见明显增多。模型组小鼠肾脏组织出现系膜基质增多,囊腔狭窄。厄贝沙坦组、肾康丸低、中、高剂量组处理后病理改变减轻,系膜区基质增生减少。Masson染色显示,模型组染色呈强阳性,纤维组织片状增生,明显纤维化;各用药干预组纤维组织增生少量分布,纤维化程度不同程度减弱。3、免疫组化和WB结果提示和正常组相比,模型组的α-sma、vimentin蛋白表达量会升高,VE-cadherin表达量降低。而与模型组比较,厄贝沙坦组、肾康丸低、中、高剂量组的α-sma、vimentin表达量降低、E-cadherin表达量升高。4、RT-PCR和WB结果显示,与正常组比较,模型组的肾组织Wntl、P-GSK-3β、β-catenin的mRNA和蛋白明显增多(p<0.05);而与模型组比较,肾康丸干预后的小鼠肾脏中的肾组织Wnt1、P-GSK-3β、β-catenin的mRNA和蛋白均低于模型组(P<0.05)。厄贝沙坦组与肾康丸组之间无显著差异(P>0.05)。结论:Wnt/β-catenin信号通路活化参与DN小鼠肾纤维化的发病过程,肾康丸可以改善DN模型小鼠的肾功能,抑制肾脏纤维化。其机制可能会通过下调Wnt1、β-catenin、P-GSK-3β等的表达,抑制Wnt/β-catenin通路活化,从而上调VE-cadherin表达,减少α-SMA、Vimentin表达,从而抑制EndMT,起到抗肾纤维化的作用。肾康丸可以通过调控β-catenin来抑制EndMT的发展从而阻止和延缓肾纤维化进展,为DN的治疗提供新的研究机制。