研究背景蛋白质组学(Proteomics)是对一个基因组、一种生物或一种细胞/组织表达全套蛋白质以及特定细胞所有蛋白质异构体和翻译后修饰，蛋白质间相互作用，蛋白质复合物结构等进行研究的科学。二维凝胶电泳、质谱技术以及生物信息学技术通过对蛋白质进行高通量分离和鉴定成为蛋白质组学研究中较可靠的技术平台。其中，二维凝胶电泳运用蛋白质不同的等电点和分子量化学物理特性对蛋白质进行垂直分离，具有灵敏、高效的特点，并可与质谱分析技术匹配。目前，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术作为质谱技术的核心之一，以其高通量、快速、直接提供蛋白质和多肽分子量和结构的信息的特点，对蛋白质种类和性质进行鉴定。生殖健康作为一门新的综合性的“大科学”，内容主要包括生殖细胞的发生、成熟、受精、胚胎的早期发育、胎儿形成，直到出生、成长、性成熟等环节，其中生殖细胞的发生和成熟、受精和胚胎植入和早期发育是最重要的环节。随着人类宏大的生命科学工程——人类基因组计划全序列测定工作的完成，提供了全套的人类基因的物理图和序列图，这为进一步揭示生命的奥秘提供了重要的信息平台。尽管在这样丰富的生命科学研究积累中，我们对生殖现象中的关键环节的功能基因以及编码蛋白功能以及调控模式，以及它们与生殖相关疾病之间的关系还不甚清楚。正是在这样的机遇和挑战中，由蛋白质组学提供的强大的理念和技术平台，在包括生殖领域在内的重要生命现象和人类重大疾病的研究中获得广泛应用，并取得了突破性成绩，从而奠定其在生命研究领域的不可替代的地位。其中，早期妊娠流产作为危害妇女生殖健康的重要原因之一，发病率居高不下。早期妊娠流产是多因素疾病，其病理发生涉及母胎界面多种细胞和分子之间复杂的作用机制。目前，我们尚缺乏对EPL母胎界面细胞与分子间存在的动态的对话框的系统认识。因此，从整体上研究早期妊娠流产母胎界面的蛋白表达谱的改变，对于揭示早期妊娠流产发生的分子机制、实现疾病的早期预测和有效、合理的干预具有非常重要的意义。应用高通量、大规模、系统性的研究方法可在最大程度上再现早期妊娠或其相关疾病病理状态中重要蛋白之间网络状或平行式的作用模式，蛋白质组学研究满足这一要求。另一方面，随着不孕人口的不断增加，人们不断寻求提高针对不孕各个环节的最佳处理方案。众所周知，卵泡液为卵母细胞的发育和成熟提供了重要的环境，同时在一定程度上影响其发育潜能。在不孕治疗中，正确预测卵母细胞的发育潜能是决定妊娠结局的重要环节。前期的研究已发现了卵泡液中一些蛋白具有预测卵母细胞成熟价值的蛋白质，但是由于卵泡液成分复杂，对蛋白的实际检测步骤烦琐，限制了这些具有预测价值的蛋白的开发。因此，一直以来，研究者投入了众多资源致力于对新型标志物的开发，基于凝胶的电泳方法联合高效质谱技术的蛋白质组学方法以及直接对细胞和体液进行生物质谱检测技术在寻找具有诊断前景的生物标志物的研究中可提供强大的支持和成功经验。综上，本研究拟根据目前国际发展趋势和国内现有研究基础，以生殖调节的两个靶点(早期妊娠和卵母细胞发育和成熟)为切入点，应用强大的蛋白质组学研究平台结合生物信息学等研究手段，拟通过探讨早期妊娠流产母胎界面的分子网络调节机制以及寻找卵母细胞的发育及成熟的标志物，以期为深入研究生殖调控机理提供丰富和有价值的信息。第一部分绒毛组织二维凝胶电泳技术的建立并优化方案的比较研究目的建立并优化用于早期妊娠绒毛组织的二维凝胶电泳技术。材料和方法以固相pH梯度等电聚焦电泳为第一向，采用垂直十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳为第二向进行双向电泳，对关键步骤如样品裂解方案和电泳参数进行一系列的优化。同时结合计算机辅助的图象分析软件，比较早期妊娠流产和正常绒毛组织总蛋白的表达差异。结果1．通过分析二维凝胶电泳图谱，早期妊娠流产组检测到1735±121蛋白斑点，对照组检测到1552±153蛋白斑点。匹配结果显示早期妊娠流产组匹配的蛋白斑点为819±36，对照组为681±156，平均匹配率分别为85.16％、83.20％。2．第一向等电聚焦方向位置标准差为0.8916±0.3474，第二向垂直电泳方向标准差为0.9253±0.5399；蛋白斑点表达量变异系数为23.21％±17.51％。3．30个蛋白斑点在流产组中表达量较对照组增加或减少2倍以上。经Student’s t-test检验，发现18个点表达量两组有显著差异(P＜0.05)，其中8个点在早期妊娠流产组中表达水平上调，另10个点在流产组中表达水平下调。结论采用蛋白质裂解能力强的配方提取组织蛋白质，有利于二维凝胶电泳图谱的完整性。质谱兼容的银染方法不降低蛋白质点的分辨率，窄范围(pH4-7)固相pH梯度胶条具有较高的分辨率。差异蛋白点的发现有助于早期妊娠流产病理生理分子机制的研究。第二部分早期妊娠流产绒毛组织蛋白质组学研究研究目的通过对早期妊娠流产与正常绒毛组织表达差异的蛋白进行鉴定，以助于阐明早期妊娠流产病理发生机制。材料和方法根据第一部分对早期妊娠流产绒毛组织进行二维凝胶电泳实验并用相应软件分析数字化的凝胶图像，找出早期妊娠流产组绒毛组织表达有差异的蛋白斑点，采用胶内酶解消化方法得到差异蛋白斑点多肽混合物，用基质辅助激光解吸-飞行时间质谱进行蛋白质性质鉴定，最后采用免疫组织化学和蛋白免疫印记实验方法对鉴定蛋白进行验证。结果1．通过胶内酶解消化、质谱分析得到差异表达的蛋白斑点的肽质指纹图谱，通过MASCOT搜索引擎在NCBI蛋白质数据库中检索，其中12个蛋白斑点得到成功鉴定。这些鉴定蛋白质包括与氧代谢相关酶如超氧化物歧化酶、过氧还酶-3和硫氧环样蛋白-1；与调亡有关的Fas抑制因子；胎盘分泌的蛋白质激素如胎盘催乳素和甲状腺运载蛋白；与细胞转录和生长有关的蛋白如S100钙结合蛋白A11和galectin-1；与细胞周期调控相关的RNA结合蛋白；以及其它一些功能未知蛋白。这些蛋白广泛参与细胞增殖、生长、分化、代谢、转录、凋亡等过程。2．应用免疫组织化学和蛋白免疫印记实验验证部分蛋白表达趋势，结果均与蛋白质组学结果相吻合。结论通过蛋白质组学研究技术初步鉴定了在早期妊娠流产绒毛组织中与细胞生长、代谢、分化、转录和凋亡相关的蛋白质表达发生异常变化，成为在各种不同原因致早期妊娠流产的病理生理特点，并为进一步揭示早期胎盘发育停滞以及胚胎死亡过程中可能机制提供重要的信息。第三部分早期妊娠流产蜕膜组织蛋白质组学研究研究目的通过研究早期妊娠流产与正常蜕膜组织总蛋白表达谱的改变，以助于阐明在早期妊娠流产中子宫蜕膜的病理生理特点，以及进一步探索早期妊娠流产母胎界面细胞与分子间对话机制。材料和方法5例早期(妊娠8周)妊娠流产蜕膜组织与5例同期正常蜕膜组织提取细胞总蛋白，二维凝胶电泳分离蛋白质组成分，银染染色后用相应软件分析数字化的凝胶图像，找出早期妊娠流产组蜕膜组织表达有差异的蛋白斑点，采用胶内酶解消化方法得到差异蛋白斑点多肽混合物，用基质辅助激光解吸-串联质谱进行蛋白质鉴定。结果1．通过分析二维凝胶电泳图谱，早期妊娠流产组检测到1213±97蛋白斑点，对照组检测到1277±82蛋白斑点。2．62个蛋白斑点在早期妊娠流产组中表达量较对照组增加或减少2倍以上。经Student’s t-test检验，发现22个点表达量两组有显著差异(P＜0.05)，其中13个点在流产组中表达水平上调，另9个点在流产组中表达水平下调。3．通过胶内酶解消化、基质辅助-激光解离/离子-飞行时间质谱或串联质谱分析得到差异表达的蛋白斑点的肽质指纹图谱，通过MASCOT搜索引擎在NCBI蛋白质数据库中检索，其中10个蛋白斑点成功得到鉴定。这些鉴定蛋白质包括这些鉴定蛋白质包括与内质网应激相关的蛋白葡萄糖调节蛋白78、valosin-containing protein，与蛋白降解相关的蛋白蛋白酶体亚单位、泛素碳末端酯化酶L3和Alpha-1-Antitrypsin，蜕膜细胞分泌的激素蛋白hCG，与细胞结构相关