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HCV基因组编码的NS3是一种具有多种生物学活性的非结构蛋白,它具有丝氨酸蛋白酶、RNA螺旋酶和NTP酶活性。NS3丝氨酸蛋白酶在NS4A的辅助下在HCV自身NS3/NS4A/NS4B/ NS5A/NS5B等位点进行切割,对于HCV蛋白的加工成熟过程具有重要作用。NS3/4A还参与HCV逃避宿主固有免疫系统的应答,为HCV的持续慢性感染提供条件。NS3/4A丝氨酸蛋白酶可以切割宿主TLR3和RIG-I信号通路中重要的信号分子,通过切割TRIF适配子使TRIF不能招募TBKI从而封闭TLR3信号途径,阻断TLR3介导的IFNβ基因启动子活化;在邻近线粒体结构域的508位Cys切割MAVS,破坏MAVS的线粒体定位,抑制RIG-I信号通路诱导的IRF-3的磷酸化及IFNβ活化,从而阻断干扰素抗病毒作用。可见NS3/4A是一种多功能分子,抑制其活性既可以阻断HCV的复制、翻译及翻译后蛋白加工成熟,又能使干扰素充分发挥其抗HCV作用效果。因此对其生物学功能的调节成为发展抗HCV病毒药物的重要策略之一,NS3/4A丝氨酸蛋白酶成为目前抗HCV病毒治疗研究的主要靶位。近年来靶向HCV NS3/4A抑制剂的研究取得可喜的进展,但由于缺乏合适的动物模型来对这些药物的抗HCV作用效果进行评价,极大的延缓了这些药物进入临床。对此,本课题的研究目的是建立HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性体内外监测体系,并以该监测体系为基础评价HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用效果,为新型抗HCV药物进入临床提供基础资料。具体研究内容和结果如下:第一部分活体荧光成像实时监测HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶可切割HCV NS3/NS4A/NS4B/NS5A/NS5B等自身位点,参与HCV蛋白的加工成熟过程。本研究采用荧光素酶重组与互补策略,建立了活体荧光成像实时监测HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性的细胞和动物模型。我们构建了带萤火虫荧光素酶(firefly luciferase, Fluc)报告基因的载体ANlu(c△NS5A/B)BCluc,将Fluc分成NFluc和CFluc两个片段,使其处于低活性状态。NFLuc和CFLuc的两端分别与两个可紧密结合的小分子多肽A肽和B肽相连,形成ANFLuc和BCFLuc。ANFLuc和BCFLuc的中间由NS3/4A的切割位点NS5A/B相连形成报告基因ANluc(△NS5A/B)BCluc。当其与NS3/4A共表达时,NS3/4A在ANluc(△NS5A/B)BCluc的NS5A/B位点发生蛋白水解作用,使ANFLuc和BCFLuc分离,通过A肽和B肽的紧密结合作用使NFluc和CFluc重新组合形成完整的Fluc,恢复其荧光素酶活性。在细胞水平将ANluc(△NS5A/B)BCluc与NS3/4A共转染或将其转染到HCV复制细胞中,使用双荧光素酶检测试剂盒检测荧光素酶的活性。结果表明报告基因与NS3/4A共转染或HCV复制细胞中的NS3/4A都对载体ANluc(△NS5A/B)BCluc发生了切割作用,使荧光素酶活性上调。通过水动力转染法将ANluc(△NS5A/B)BCluc与NS3/4A表达载体共转染到小鼠体内,活体荧光成像监测荧光素酶活性,得到了与细胞水平类似的结果。随后,我们使用几种NS3/4A特异的shRNA或不同浓度的IFN-α抑制NS3/4A活性,发现荧光素酶活性被抑制,荧光素酶活性与NS3/4A的表达量成正比。因此,ANluc(△NS5A/B)BCluc报告基因载体可在细胞和动物水平指示NS3/4A丝氨酸蛋白酶的活性。使用此监测体系可用来进行HCV NS3/4A丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用效果评价。第二部分基于NS3/4A切割MAVS的特性建立HCV丝氨酸蛋白酶活性监测细胞模型HCV作为一种RNA病毒,能够有效激活宿主固有免疫系统中IFN诱导信号通路,但同时HCV又通过拮抗天然免疫系统识别,干扰IFN信号通路以及抑制IFN刺激基因活化等多水平逃逸机制来逃避宿主的抗病毒活性。MAVS为IFN信号通路中一个非常重要的信号分子,HCV NS3/4A可在邻近线粒体结构域的508位Cys切割MAVS,破坏MAVS的线粒体定位,抑制RIG-I信号通路诱导的IFN-β活化。在本研究中,利用NS3/4A丝氨酸蛋白酶切割MAVS的特性,以eYFP及SEAP为报告基因,基于eYFP-MAVS激活IFNβ-SEAP的信号通路,建立了一个高灵敏的NS3/4A丝氨酸蛋白酶活性监测细胞模型。正常情况下,带有eYFP报告基因的eYFP-MAVS定位于细胞线粒体上,可激活IFN-β启动子介导的SEAP的表达。共表达NS3/4A时,eYFP-MAVS被水解,其定位由线粒体转移到细胞浆中,从而阻断了eYFP-MAVS对IFNβ-SEAP的激活作用。研究证明SEAP活性的下降与NS3/4A蛋白酶的表达量成正比。使用IFN-α处理HCV复制细胞,NS3/4A的表达量下降,SEAP活性上调。随后,我们使用此报告基因体系对CsA和CsA&IFN-α联合用药的抗HCV活性进行了分析,证明此体系可用于抗HCV药物的筛选。