【摘 要】
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目的:探索从紫色色杆菌培养物中分离纯化组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的方法;研究FK228体外对人肝癌细胞HepG2增殖、凋亡及细胞周期的影响,探讨FK228抗肿瘤作用机制,为下一步FK22
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目的:探索从紫色色杆菌培养物中分离纯化组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228的方法;研究FK228体外对人肝癌细胞HepG2增殖、凋亡及细胞周期的影响,探讨FK228抗肿瘤作用机制,为下一步FK228体内实验以及临床应用提供理论依据。
方法:应用过滤、萃取、层析及重结晶等方法从紫色色杆菌培养物中分离纯化组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228,通过波谱方法鉴定结构并与参考文献上数据对比;用分离纯化的FK228与标准品同时进行下列实验:①MTT法检测不同浓度FK228在不同作用时间对人肝癌细胞HepG2的增殖抑制率;②荧光染色观察FK228对。HepG2细胞形态学改变;③琼脂糖凝胶电泳分析细胞DNA特征;④流式细胞术检测FK228对HepG2细胞凋亡和细胞周期改变;⑤RT-PCR检测FK228对HepG2细胞P21mRNA和cdk4 mRNA表达的影响。
结果:从35升紫色色杆菌培养物中分离纯化FK228,得到纯品4.84毫克,二者在随后的体外瘤细胞抑制实验中显示出良好的一致性:组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228浓度在4~32μg·L<-1>能抑制人肝癌细胞 HepG2增殖,各剂量组及各时间组之间均有显著性统计学意义(P<0.01);经FK228作用后,呈现典型的凋亡细胞形态特征;琼脂糖凝胶电泳分析FK228处理后HepG2细胞DNA,均可见明显的细胞凋亡形成的梯状条带;流式细胞术检测结果显示,16.Oμg·L<-1>和32.0μg·L<-1>FK228使
HepG2细胞GO/Gl和S期明显增高(与对照组比较P<0.01),G2/M期变化无统计学意义;RT-PCR检测显示,FK228作用能明显促进HepG2细胞p21mRNA的表达,同时抑制cdk4 mRNA的表达(与对照组比较P<0.01)。
结论:从不同于WB968的紫色色杆菌菌株的培养物中分离纯化出微量的组蛋白去乙酰化酶抑制剂FK228;FK228能明显抑制人肝癌细胞HepG2增殖,并具有时间一剂量依赖性;FK228能诱导HepG2细胞凋亡并引起细胞周期阻滞于Gl期;p21和cdk4基因表达的改变可能是FK228诱导HepG2细胞凋亡/周期阻滞及增殖抑制的重要机制。
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