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EBNA2是EBV感染宿主细胞后最先表达的病毒基因产物之一，由BYRF1基因编码，与细胞内蛋白无任何明显的同源序列。EBNA2是一种病毒转录因子，不能直接与DNA结合，但可通过与细胞抑制重组信号结合蛋白RBP-Jκ及其它一些胞内DNA结合蛋白的结合间接作用于EBNA2反应启动子。EBNA2具有核定位序列、DNA结合部位及转录激活部位等功能区域，是首个被确定与病毒细胞转化功能有密切关系的病毒蛋白。EBNA2缺失的EBV毒株P3-HR1失去转化B细胞的能力，提示我们可以通过干扰EBNA2的表达影响其转化细胞的能力。同时作为EBV BYRF1基因特异性表达的产物，EBNA2可以反映EBV的存在情况以及在细胞内的拷贝数。RNAi是由双链RNA介导的遗传干扰现象，能够特异、有效地降解mRNA，引起转录后水平的基因沉默；研究表明，21-23nt的小干扰RNA(small interferenceRNA，siRNA)可介导哺乳动物细胞特定基因的沉默。RNAi具有高效性和高度特异性，可能成为封闭基因的新技术而在基因功能研究和疾病基因治疗中发挥重要作用。大量研究结果证实，siRNA可以有效抑制所有内源性基因的mRNA从而敲除该基因的功能，目前siRNA已经成为敲除特定基因在哺乳动物细胞系中表达的强大工具。本研究中我们化学合成了靶向EBNA2编码基因的特异性siRNA，采用脂质体法转染EBVⅢ型潜伏的胃癌上皮细胞GT38，观察分析siRNA对EBNA2基因表达的抑制作用以及靶基因沉默对GT38细胞的影响。同时构建能转录产生靶向EBNA2编码基因的siRNA的pSUPER逆转录病毒载体，进而筛选出稳定产毒的细胞克隆，以观察比较两种干涉方式对目的基因表达的抑制效果以及对靶细胞的影响。第一部分化学合成siRNA对GT38细胞EBNA2基因表达的抑制作用目的采用化学合成法合成针对EBNA2编码基因的siRNA，分别转染EBV阳性肿瘤细胞GT38细胞，观察人工合成siRNA对EBNA2的特异沉默效果以及EBNA2特异性沉默对EBV阳性肿瘤细胞的影响。方法①化学合成3组靶向EBNA2编码基因的siRNA，以EBVⅢ型潜伏的胃癌上皮细胞GT38为靶细胞，采用脂质体法分别将3组siRNA转染GT38细胞，同时设脂质体对照和细胞对照。②采用RT-PCR检测靶基因EBNA2 mRNA的转录表达水平，并筛选出最佳转染浓度及抑制效果最为理想的siRNA链。③将抑制效果最好的siRNA链以最佳转染浓度转染靶细胞，采用Hoechst 33258、透射电镜和流式细胞术检测GT38细胞周期和凋亡的变化。结果①RT-PCR检测结果表明，与未转染siRNA的细胞对照相比，siRNA789、siRNA764和siRNA257对GT38细胞EBNA2的表达均具有明显的抑制作用(P＜0.01)，其中以siRNA789的抑制作用更强；②与未转染的细胞对照比较，转染siRNA789后48h和72h GT38细胞中EBNA2 mRNA表达水平明显下降，两两间比较均有显著性差异(P＜0.01)，而siRNA789转染后24h抑制效果不明显(P＞0.05)；③在0～50nM浓度范围内siRNA789转染72h后EBNA2 mRNA转录表达水平随浓度增加而逐渐降低，差别均有统计学意义(P＜0.05)；当siRNA作用浓度为50nM～100nM siRNA各组间差别不明显(P＞0.05)，转染非特异siRNA细胞组与细胞对照比较无显著性差异(P＞0.05)；④Hoechst 33258染色和透射电镜结果显示，与对照组比较，实验组GT38细胞未见胞核浓缩，也未观察到凋亡小体；流式细胞分析结果表明，与对照组比较，实验组细胞未出现凋亡，但其S其细胞数量明显减少。结论化学合成siRNA能有效抑制GT38细胞中EBNA2编码基因的表达，其抑制作用具有时间依赖性，在一定浓度范围内呈明显的量效关系，且对靶基因的特定序列具有较强的选择偏向性。化学合成siRNA诱导EBNA2编码基因沉默后，不能引起靶细胞明显的凋亡，但可引起靶细胞S期数量减少。第二部分特异性沉默BV潜伏期基因EBNA2 pSUPER retro RNAi系统的构建目的构建能转录产生靶向EBV核抗原EBNA2编码基因siRNA的pSUPER逆转录病毒载体，并筛选出稳定产毒的细胞克隆。方法采用DNA重组技术将60nt能转录产生靶向EBNA2小发夹RNA(small hairpin RNA，shRNA)的寡核苷酸序列定向克隆入逆转录病毒载体pSUPER.retro.neo gfp，并用限制性内切酶酶切鉴定以及测序鉴定；脂质体法将重组逆转录病毒载体转染包装细胞系PA317，G418筛选获得稳定产生逆转录病毒的细胞克隆。结果酶切鉴定及测序鉴定结果表明插入片段的序列和方向完全正确；重组载体转染包装细胞后可表达绿色荧光蛋白，经G418筛选获得可稳定产生逆转录病毒的抗性细胞克隆；病毒滴度为2.5×10~5 CFU／ml。结论成功构建了能转录产生靶向EBV核抗原EBNA2编码基因siRNA的pSUPER逆转录病毒载体，经PA317细胞包装筛选出稳定产毒的细胞克隆，为进一步探讨EBNA2在EBV相关肿瘤发生发展的生物学意义提供了实验基础。