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背景鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是来源于鼻咽上皮组织的一种头颈部恶性肿瘤,大多数为非角化未分化癌,其恶性化程度高,极易转移,早期诊断困难。我国是鼻咽癌高发病率国家,在我国南方特别是广东省发病率高。鼻咽癌患者的治疗以放疗和化疗为主,而早期诊断、早期治疗则是挽救患者生命和提高生活质量的有效手段。但鼻咽癌起病隐匿,有较强的转移倾向,转移早,易复发,大约75%左右患者首诊既被确诊为中晚期。鼻咽癌患者的五年生存率维持在70%左右,仍有30%多的患者由于转移和复发不能长期生存。因此,阐明鼻咽癌发生,复发和转移的分子机制,筛选鼻咽癌的肿瘤标志物,寻找治疗新靶点对鼻咽癌诊疗具有重要的临床意义。多能氨酰基-t RNA合成酶作用蛋白(Aminoacyl-t RNA synthetase interacting multifunctional proteins,AIMPs)是人类t RNA合成酶复合物的支架蛋白,也是酰基-t RNA连接酶复合物的核心蛋白。AIMPs家族有三个亚型蛋白:AIMP1,AIMP2,AIMP3。AIMP2(也被称为p38/JTV-1蛋白),是AIMPs家族三个亚型之一,参与多种生物学功能,如细胞分化,细胞凋亡等。最近的研究表明,AIMP2的一个缺少外显子Exon2的转录本AIMP2-DX2也与肿瘤相关,但功能与AIMP2不同。AIMP2-DX2在多种肿瘤细胞系及肿瘤组织中被检测到。与AIMP2类似,AIMP2-DX2也能够结合FBP、TRAF2及p53,故AIMP2-DX2与AIMP2竞争性结合目标蛋白,从而抑制AIMP2的功能,表现为促癌因子。AIMP2-DX2与AIMP2的比例与肺癌病人的恶性程度正相关,与卵巢癌的抗药性正相关。抑制AIMP2-DX2水平可显著抑制肺癌细胞分化及其在裸鼠体内的成瘤。这些研究表明,AIMP2-DX2可能是有潜力的癌症新靶点。基质金属蛋白酶(MMPs)是一组锌依赖型的蛋白水解酶,它主要是负责细胞外基质蛋白的降解和重塑。MMPs在成体组织中的表达和活性相对较低,但在出现病理状况异常的组织中显著增加,例如炎性疾病,肿瘤生长和转移。近年来,MMPs是抗肿瘤侵袭转移机制研究的热点。在各种MMPs成员中,MMP-2和MMP-9与多种肿瘤的侵袭转移表型关系最为密切,其主要作用底物是IV型胶原、明胶、弹力蛋白等,它们是基底膜及ECM的主要成分。基底膜的降解意味着肿瘤的浸润与转移。鼻咽癌组织中MMP-2和MMP-9的活性水平均显著高于正常鼻咽组织,并且与鼻咽癌的临床分期密切相关。文献表明,抑制MMP-2及MMP-9可以抑制鼻咽癌细胞的侵袭与转移。所以,MMP-2及MMP-9对鼻咽癌细胞的侵袭与转移至关重要,是抑制其侵袭及转移的关键靶点。目前AIMP2-DX2在鼻咽癌中的作用未见报道,而AIMP2-DX2调控肿瘤转移的具体机制也亟待阐明,本研究以人高分化鼻咽癌细胞株(CNE-1)为研究对象,拟通过分子克隆、转染、q PCR和T-PCR、western blot等分子生物学手段,流式细胞术、MTT、transwell侵袭及迁移等实验方法,进一步建立CNE-1鼻咽癌细胞的裸鼠成瘤模型,观察AIMP2-DX2对鼻咽癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,检测基质金属蛋白酶(MMPs)中关键分子MMP-2及MMP-9核酸水平和蛋白水平的变化,阐明MMP-2及MMP-9水平变化与AIMP2-DX2的关系,探讨AIMP2-DX2调控鼻咽癌细胞迁移与侵袭的相关机制。目的(1)明确AIMP2-DX2与鼻咽癌侵袭转移的关系。(2)研究MMP-2及MMP-9水平变化与AIMP2-DX2的关系,探讨AIMP2-DX2调控鼻咽癌细胞迁移与侵袭的相关机制。材料和方法(1)应用免疫组化、Western blot及q RT-PCR技术检测正常鼻咽组织与临床病人鼻咽癌样本中AIMP2-DX2和AIMP2-F(全长)的表达差异。(2)通过Western blot、RT-PCR及侵袭迁移实验比较正常鼻咽细胞与鼻咽癌细胞相关促癌基因的表达情况以及侵袭迁移的情况;构建AIMP2-DX2真核过表达质粒,应用细胞增殖实验、细胞体外侵袭实验,流式细胞术等实验手段观察AIMP2-DX2对肿瘤细胞生长、迁移和侵袭、凋亡的影响。(3)构建沉默sh AIMP2-DX2的CNE-1稳定细胞株,AIMP2-DX2基因沉默对鼻咽癌细胞迁移和侵袭的影响。(4)构建鼻咽癌裸鼠成瘤动物模型,检测沉默AIMP2-DX2对裸鼠鼻咽癌模型皮下成瘤性影响。(5)所有统计处理均用SPSS22.0统计软件进行,数据用均数±标准差(mean±standard deviation,SD)表示,采用方差分析进行差异显著性分析(ANOVA),P<0.05表示差异具有统计学意义。结果(1)与正常鼻咽样本相比,临床病人鼻咽癌样本中AIMP2-DX2的表达明显增高,差异有统计学意义(p<0.05);AIMP2-F无显著变化;q RT-PCR结果提示鼻咽癌组织与正常鼻咽组织相比AIMP2-DX2的表达明显增高,差异有统计学意义(p<0.05);而二者AIMP2-F表达无明显差异。AIMP2-DX2低表达组的5年生存率明显高于AIMP2-DX2高表达组,两者之间差异具有统计学意义(P=0.018),提示AIMP2-DX2的表达量与鼻咽癌患者的预后相关。(2)Transwell小室迁移和Matrigel侵袭实验结果提示CNE-1细胞株中AIMP2-DX2过表达和干扰的结果表明,细胞的迁移和侵袭与AIMP2-DX2的表达成正相关。(3)与人永生化鼻咽上皮细胞系比较,鼻咽癌细胞系中AIMP2-DX2的m RNA水平及蛋白水平升高,基质金属蛋白酶MMP-2及MMP-9的水平升高,细胞的迁移和侵袭能力增强,差异有统计学意义(p<0.05)。(4)q RT-PCR及Western blot结果显示sh-AIMP2-DX2慢病毒能明显抑制CNE-1细胞AIMP2-DX2的表达,抑制AIMP2-DX2显著抑制鼻咽CNE-1细胞的迁移和侵袭,同时也能抑制在CNE-1细胞的侵袭和浸润过程中起到重要作用的调节蛋白MMP-2及MMP-9的表达,差异有统计学意义(p<0.05)。(5)在裸鼠成瘤模型中,CNE-1细胞系的肿瘤成瘤可被sh-AIMP2-DX2抑制。结论(1)临床病人鼻咽癌组织中AIMP2-DX2的表达明显增高,且与病人预后相关。(2)AIMP2-DX2是调控鼻咽癌细胞增殖,迁移和侵袭能力的充分必要条件(过表达及小分子干扰)。(3)sh-AIMP2-DX2慢病毒能明显抑制CNE-1细胞AIMP2-DX2,沉默AIMP2-DX2基因引发MMP-2及MMP-9基因的表达下调。(4)沉默AIMP2-DX2可抑制CNE-1细胞的迁移和侵袭,可抑制CNE-1细胞的裸鼠模型中的成瘤生长。