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家蚕(Bombyx mori)是以卵滞育的昆虫,是一种重要的模式生物,其滞育性与蚕种生产密切相关,因此,家蚕滞育及滞育解除机制的研究具有重要的意义。为从分子水平上深入研究家蚕滞育和滞育解除的基因调控机制,本文利用生物信息学、分子生物学、基因工程和荧光定量PCR等技术方法,对与滞育及滞育解除相关联的基因进行克隆和表达分析,获得主要结果如下: 1、对与家蚕滞育相关联的家蚕磷脂酰乙醇胺结合蛋白(BmPEBP)和家蚕化学感应蛋白7(BmCSP7)进行了生物学分析,家蚕磷脂酰乙醇胺结合蛋白由195个氨基酸组成,家蚕化学感应蛋白7由122个氨基酸组成。在此基础上成功克隆了这两个蛋白相对应的基因BmPEBP和BmCSP7,构建了重组表达载体pET-32a-BmPEBP和pET-32a-BmCSP7,并获得基因表达。 2、提取932品种产后经过1-7d的滞育卵和即时浸酸卵的总RNA,逆转录为cDNA,以合成的cDNA第一链作为模板,利用跨内含子设计引物,采用实时荧光定量PCR的方法,检测BmPEBP、BmCSP7在蚕卵中的mRNA相对表达量。在即时浸酸卵中,随着蚕卵的发育,BmPEBP和BmCSP7基因的表达量逐渐增高,第7d时的相对表达量2-△△ct分别达到12.2和5.0。而在滞育卵中,随着滞育程度的逐渐加深,BmPEBP和BmCSP7基因的表达量逐渐下降,BmPEBP在第7d检测出的相对表达量和BmCSP7在第4d检测出的表达量都仅为0.02。 3、利用荧光定量PCR技术,检测BmPEBP、BmCSP7基因在家蚕5龄期至蛹期血液和生殖腺组织中的转录表达情况。在蚕的血液中,BmPEBP基因在5龄期、吐丝期几乎检测不到表达,但到蛹期后则随发育经过迅速增加,蛹期第7d时的相对表达量2-△△ct为294;_BmCSP7基因却在吐丝期的有较高表达量,相对表达量2-△△ct为168,在5龄幼虫和蛹期只有微量表达。而在生殖腺中,BmPEBP基因的表达量在5龄逐渐升高,5龄7d的表达量2-△△ct最大为5.2,随后在吐丝期和蛹期逐渐降低;BmCSP7在5龄期和吐丝期均检测不到表达,到蛹期后随发育经过逐渐增加,蛹期第7d的相对表达量2-△△ct为225。 4、选取漹赤品种的滞育卵和加秋品种的非滞育卵,检测BmPEBP、BmCSP7、BmAN、BmAK2、BmID、BmGGT基因在卵期1d、3d、5d、7d的转录表达情况。BmAN、BmCSP7基因在滞育与非滞育卵中均表达;BmAK2、BmGGT基因在滞育卵中表达而在非滞育卵中不表达;BmPEBP基因在非滞育卵中表达、在滞育中只有微量表达。BmID基因在滞育和非滞育卵中均不表达。表明.BmAK2、BmGGT基因与滞育有关,BmPEBP基因与非滞育有关,BmAN、BmCSP7基因与滞育和非滞育都有关,BmID基因与滞育和非滞育关系不密切。