论文部分内容阅读
家蚕(Bombyx mori)是以卵滞育的昆虫，是一种重要的模式生物，其滞育性与蚕种生产密切相关，因此，家蚕滞育及滞育解除机制的研究具有重要的意义。为从分子水平上深入研究家蚕滞育和滞育解除的基因调控机制，本文利用生物信息学、分子生物学、基因工程和荧光定量PCR等技术方法，对与滞育及滞育解除相关联的基因进行克隆和表达分析，获得主要结果如下： 1、对与家蚕滞育相关联的家蚕磷脂酰乙醇胺结合蛋白(BmPEBP)和家蚕化学感应蛋白7(BmCSP7)进行了生物学分析，家蚕磷脂酰乙醇胺结合蛋白由195个氨基酸组成，家蚕化学感应蛋白7由122个氨基酸组成。在此基础上成功克隆了这两个蛋白相对应的基因BmPEBP和BmCSP7，构建了重组表达载体pET-32a-BmPEBP和pET-32a-BmCSP7，并获得基因表达。 2、提取932品种产后经过1-7d的滞育卵和即时浸酸卵的总RNA，逆转录为cDNA，以合成的cDNA第一链作为模板，利用跨内含子设计引物，采用实时荧光定量PCR的方法，检测BmPEBP、BmCSP7在蚕卵中的mRNA相对表达量。在即时浸酸卵中，随着蚕卵的发育，BmPEBP和BmCSP7基因的表达量逐渐增高，第7d时的相对表达量2-△△ct分别达到12.2和5.0。而在滞育卵中，随着滞育程度的逐渐加深，BmPEBP和BmCSP7基因的表达量逐渐下降，BmPEBP在第7d检测出的相对表达量和BmCSP7在第4d检测出的表达量都仅为0.02。 3、利用荧光定量PCR技术，检测BmPEBP、BmCSP7基因在家蚕5龄期至蛹期血液和生殖腺组织中的转录表达情况。在蚕的血液中，BmPEBP基因在5龄期、吐丝期几乎检测不到表达，但到蛹期后则随发育经过迅速增加，蛹期第7d时的相对表达量2-△△ct为294；_BmCSP7基因却在吐丝期的有较高表达量，相对表达量2-△△ct为168，在5龄幼虫和蛹期只有微量表达。而在生殖腺中，BmPEBP基因的表达量在5龄逐渐升高，5龄7d的表达量2-△△ct最大为5.2，随后在吐丝期和蛹期逐渐降低；BmCSP7在5龄期和吐丝期均检测不到表达，到蛹期后随发育经过逐渐增加，蛹期第7d的相对表达量2-△△ct为225。 4、选取漹赤品种的滞育卵和加秋品种的非滞育卵，检测BmPEBP、BmCSP7、BmAN、BmAK2、BmID、BmGGT基因在卵期1d、3d、5d、7d的转录表达情况。BmAN、BmCSP7基因在滞育与非滞育卵中均表达；BmAK2、BmGGT基因在滞育卵中表达而在非滞育卵中不表达；BmPEBP基因在非滞育卵中表达、在滞育中只有微量表达。BmID基因在滞育和非滞育卵中均不表达。表明.BmAK2、BmGGT基因与滞育有关，BmPEBP基因与非滞育有关，BmAN、BmCSP7基因与滞育和非滞育都有关，BmID基因与滞育和非滞育关系不密切。