背景与目的：原发性肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是常见的消化道恶性肿瘤,发病率及死亡率均较高。目前,手术切除仍是治疗HCC的最佳手段。但是80%的患者在诊断时已属晚期,失去手术机会,而对于那些手术患者,其两年内的复发率也高达50%。全身性化疗是治疗肝癌尤其是无手术指征的晚期肝癌的重要方法,但现有的化疗药物,不论是单药治疗还是多药联合治疗疗效均不理想。因此寻找新的有价值治疗手段和策略显得十分必要。从天然产物中寻求高效、低毒的新型抗肝癌药物并深入探讨其抗肿瘤机制是当前国内外研究的重要课题。褪黑素(melatonin, MT)自1958年被分离提纯以来,其功能逐渐被人们所认识。褪黑素化学名称为N-乙酰基-5-甲氧基色胺,主要由机体的松果体合成分泌,视网膜、淋巴细胞、皮肤、胃肠道、骨髓等也可以产生褪黑素。褪黑素的合成原料为色氨酸,经过羟化酶,脱羧酶,N-乙酰转移酶和甲基转移酶催化,最后合成褪黑素。褪黑素分泌后迅速进入血液循环,分布到全身各部位,对机体多数器官和组织细胞发挥作用。现已证实,褪黑索与节律性调节、神经内分泌调节、免疫调节、清除自由基、催眠镇痛以及延缓衰老等有密切关系。除此之外,许多研究发现褪黑素可对多种癌症具有抗增殖效果,如乳腺癌、肺癌、转移性肾细胞癌、肝癌、恶性肿瘤的脑转移、卵巢癌、神经母细胞瘤、膀胱癌、白血病等,褪黑素的抗肿瘤作用研究已经成为研究热点。本课题拟分两个部分探讨褪黑素在逆转肝癌细胞凋亡抵抗及内质网应激介导的化疗抵抗中的作用及机制,以期为肝癌的临床治疗提供新的方法和思路。研究一褪黑素在肝癌细胞凋亡抵抗中的作用及机制研究方法：(1)采用MTT法、流式细胞仪(Flow Cytometry, FCM)、末端双脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口标记技术(termina] deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)观察褪黑素对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的增殖及凋亡的影响。(2)收集肝癌组织标本100例,应用免疫组织化学方法观察IAPs和COX-2在肝癌组织的表达,并分析COX-2与IAPs表达的相关性；FCM、TUNEL法观察COX-2选择性抑制剂NS-398和PI3K抑制剂LY294002对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的凋亡作用；Western-blot方法分析COX-2选择性抑制剂NS-398和PI3K抑制剂LY294002对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞COX-2,p-AKT,XIAP,Survivin和cIAP-1表达的影响；Western-blot方法分析褪黑素对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞COX-2,p-AKT,XIAP,Survivin和cIAP-1表达的影响。结果1.褪黑素对肝癌细胞增殖及凋亡的影响(1)采用MTT法,观察褪黑素对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的增殖抑制作用。结果显示褪黑素(10-7～10-2mol/L)对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞有增殖抑制作用,药物浓度越高,抑制作用越强。系列浓度褪黑素(10-7～10-3mol/L)作用于HepG2和SMMC-7721肝癌细胞24h和48h后观察细胞的生长情况,结果显示褪黑素作用时间越长,对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的抑制作用越强。而10-9mol/L褪黑素对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的增殖无抑制作用。(2) TUNEL观察HepG2和SMMC-7721肝癌细胞凋亡的形态学改变。褪黑素(10-7～10-2mol/L)作用HepG2和SMMC-7721肝癌细胞48h后,细胞密度均减少,随着褪黑素浓度的增加,凋亡细胞比例逐渐增加。应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。FCM结果显示,正常对照组可见低矮的凋亡峰,褪黑素(10-7～10-3mol/L)作用HepG2和SMMC-7721肝癌细胞48h后,随着褪黑素浓度增加,凋亡率逐渐增加。提示褪黑素对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的增殖有抑制作用,并可诱导肝癌细胞凋亡。2.褪黑素逆转肝癌细胞凋亡抵抗的可能分子机制(1)应用免疫组织化学方法检测100例肝细胞癌中IAPs和COX-2的表达,肝癌组织中XIAP, Survivin, cIAP-1, cIAP-2, Livin的阳性率分别为76%,79%,83%,63%,17%,肝癌组织中COX-2阳性表达率为71%。COX-2和XIAP, Survivin, cIAP-1蛋白的表达成显著正相关(P<0.05)。(2)采用TUNEL法观察HepG2和SMMC-7721肝癌细胞凋亡的形态学改变。研究发现对照组细胞增殖旺盛,可见少许凋亡细胞；使用COX-2选择性抑制剂NS-398(50μmol/L)和PI3K抑制剂LY294002(30μmol/L)作用HepG2和SMMC-7721肝癌细胞48h后,细胞密度均明显减少,凋亡细胞比例明显增加。应用流式细胞仪检测细胞凋亡率。FCM结果显示,正常对照组可见低矮的凋亡峰,COX-2选择性抑制剂NS-398(50μmol/L)和PI3K抑制剂LY294002(30μmol/L)作用HepG2和SMMC-7721肝癌细胞48h后,其凋亡率增加。(3)采用Western Blot法观察COX-2选择性抑制剂NS-398(50μmol/L)和PI3K抑制剂LY294002(30u mol/L)作用于HepG2和SMMC-7721肝癌细胞48h,对COX-2, p-AKT, XIAP, Survivin, cIAP-1表达的影响。结果表明,COX-2选择性扣制剂NS-398在抑制HepG2和SMMC-7721肝癌细胞COX-2表达的同时,也下调XIAP和Survivin的表达,但对cIAP-1的表达无影响,提示抑制COX-2继而下调XIAP和Survivin可逆转肝癌细胞凋亡抵抗,进一步研究发现使用COX-2选择性抑制剂NS-398及和PI3K抑制剂LY294002均可在抑制HepG2和SMMC-7721肝癌细胞p-AKT的表达同时,伴有XIAP和Survivin的下调,提示通过抑制COX-2/PI3K/AKT通路下调XIAP和Survivin的表达可逆转肝癌细胞凋亡抵抗。(4)Western-blot法观察褪黑素(10-7～10-3mol/L)作用HepG2和SMMC-7721肝癌细胞48h后,对COX-2, p-AKT, XIAP, Survivin,cIAP-1,表达的影响。结果表明,使用系列浓度褪黑素(10-7～10-3mol/L)作用于HepG2和SMMC-7721肝癌细胞48h后,COX-2, p-AKT, XIAP, Survivin的表达随褪黑素浓度的增加,表达逐渐减少,与NS-398和LY294002作用于肝癌细胞COX-2, p-AKT,XIAP,Survivin表达的结果类似。提示褪黑素可能通过COX-2/PI3K/AKT途径下调XIAP和Survivin的表达逆转肝癌细胞凋亡抵抗。研究二褪黑素在内质网应激诱导肝癌细胞对化疗药物抵抗中的作用及机制研究方法(1)采用MTT法观察TM诱导的内质网应激对阿霉素抑制HepG2和SMMC-7721肝癌细胞增殖的作用；采用流式细胞仪、TUNEL检测法观察TM诱导的内质网应激对阿霉素诱导HepG2和SMMC-7721肝癌细胞凋亡的影响。(2)采用MTT法观察褪黑素在TM诱导的内质网应激状态下对阿霉素抑制HepG2和SMMC-7721肝癌细胞增殖的作用；采用流式细胞仪、TUNEL法观察褪黑素在TM诱导的内质网应激状态下对阿霉素诱导HepG2和SMMC-7721肝癌细胞凋亡的影响。(3) Western-blot法观察TM诱导的内质网应激对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞p-AKT, CHOP和Survivin表达的影响；流式细胞仪、TUNEL法观察PI3K抑制剂LY294002在TM诱导的内质网应激状态下对阿霉素诱导肝癌细胞凋亡的影响；用Western-blot法观察PI3K抑制剂LY294002对内质网应激诱导的HepG2和SMMC-7721肝癌细胞p-AKT, CHOP和Survivin表达的影响；用Western-blot法观察褪黑素对内质网应激诱导的HepG2和SMMC-7721肝癌细胞p-AKT, CHOP和Survivin表达的影响。结果1.内质网应激在肝癌细胞对阿霉素敏感性中的作用(1)采用MTT法,观察衣霉素(tunicamycin, TM)处理组、阿霉素处理组及TM预处理的阿霉素组对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的增殖抑制作用。与阿霉素处理组相比,TM预处理的阿霉素组的细胞增殖抑制率明显下降。(2)采用FCM和TUNEL法,观察对照组、TM处理组、阿霉素处理组及TM预处理的阿霉素组对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的凋亡。与阿霉素处理组相比,TM预处理的阿霉素组的细胞凋亡率明显下降。提示内质网应激可诱导肝癌细胞对化疗药物产生抵抗。2.褪黑素在内质网应激诱导肝癌细胞对阿霉素抵抗中的作用(1)采用MTT法,观察阿霉素处理组、TM处理的阿霉索组及不同浓度褪黑素(10-7～10-3mol/L)+TM处理的阿霉素组对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的增殖抑制作用。与阿霉素处理组相比,TM预处理的阿霉素组的细胞增殖抑制明显下降；与TM预处理的阿霉素组相比,褪黑素(10-5～10-3mol/L)+TM预处理的阿霉素组的细胞增殖抑制率明显提高,但10-7mol/L褪黑素+TM预处理的阿霉素组细胞增殖抑制率无明显提高。(2)采用FCM和TUNEL法,观察阿霉素处理组、TM预处理的阿霉素组及褪黑素(10-3mol/)+TM预处理的阿霉素组对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的凋亡的影响。与阿霉素处理组相比,TM预处理的阿霉素组的凋亡率明显下降；与TM预处理的阿霉素组相比,褪黑素(10-3mol/)+TM预处理的阿霉素组的凋亡率明显提高。提示褪黑素可逆转内质网应激诱导的肝癌细胞对化疗药物的抵抗。3.褪黑素逆转内质网应激诱导肝癌细胞对化疗抵抗的机制(1)用Western-blot法观察TM作用于HepG2和SMMC-7721肝癌细0h,4h,8h后GRP78, p-AKT的表达情况。结果表明,使用TM作用HepG2和SMMC-7721肝癌细胞4h即可诱导GRP78表达的增多,提示内质网应激的产生,并且p-AKT的表达随时间的延长逐渐增加。同时用Western-blot法观察TM处理后HepG2和SMMC-7721肝癌细胞内质网应激性凋亡的关键分子CHOP和凋亡抑制蛋白Survivin的表达情况。结果表明,使用TM作用于HepG2和SMMC-7721肝癌细胞后,Survivin的表达随时间的延长逐渐增加,而CHOP与不加诱导剂的空白对照组相比,无明显差别。(2)采用FCM和TUNEL法,观察阿霉素处理组、TM预处理的阿霉素组及LY294002+TM预处理的阿霉素组对HepG2和SMMC-7721肝癌细胞凋亡的影响。与阿霉素处理组相比,TM预处理的阿霉素组的细胞凋亡率明显下降；与TM预处理的阿霉素组相比,LY294002+TM预处理的阿霉素组的细胞凋亡率明显提高。提示抑制p-AKT可逆转内质网应激诱导的肝癌细胞对化疗药物的抵抗。(3)用Western-blot法观察PI3K抑制剂LY294002对内质网应激诱导的HepG2和SMMC-7721肝癌细胞CHOP和Survivin的表达的影响,结果表明,使用PI3K抑制剂LY294002抑制内质网应激诱导的p-AKT的同时,HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的CHOP表达增多,Survivin表达下降。提示抑制PI3K/AKT通路继而调控CHOP和Survivin的表达可逆转内质网应激诱导的肝癌细胞对化疗药物的抵抗。(4)用Western-blol法观察褪黑素对内质网应激诱导的HepG2和SMMC-7721肝癌细胞p-AKT, CHOP和Survivin的表达的影响。结果表明,使用褪黑素可抑制内质网应激诱导的HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的p-AKT的表达,且随褪黑素浓度的增加p-AKT的表达逐渐下降,同时,在褪黑素抑制内质网应激诱导的p-AKT的同时,HepG2和SMMC-7721肝癌细胞的CHOP表达增多,Survivin表达下降,与PI3K抑制剂LY294002作用内质网应激诱导的肝癌细胞CHOP和Survivin的表达结果相似。提示褪黑素可能通过PI3K/AKT通路上调CHOP的表达和下调Survivin的表达逆转内质网应激诱导的肝癌细胞对化疗药物的抵抗。结论1.褪黑素可能通过COX-2/PI3K/AKT通路调控XIAP和Survivin的表达逆转肝癌细胞凋亡抵抗。2.褪黑素可能通过PI3K/AKT通路调控CHOP和Survivin的表达逆转内质网应激诱导的肝癌细胞对化疗药物的抵抗。