研究背景和目的S100家族是EF-手型钙结合蛋白家族中最大的多基因家族,绝大部分作为钙受体结合蛋白发挥作用,参与细胞结构的形成、酶活性的调节及细胞间信号传导等。该家族中16个成员(包括S100A9)的基因定位于1号染色体长臂2区1带(1q21),该区段稳定性较差,易发生多种染色体重排,从而引起S100基因表达的失控。近年来发现S100异常表达于多种肿瘤组织中,且与疾病的分期和预后相关。S100A9(calgranulin B,MRP14)是S100蛋白家族的成员,最初发现表达于髓系细胞分化过程中,且以粒细胞和单核细胞中表达最高。越来越多研究证实多种肿瘤中也存在S100A9的高表达;我们前期发现S100A9促进肝癌HepG2细胞的增殖和侵袭、促进结直肠癌细胞增殖和转移。这些结果都提示S100A9与肿瘤的发生发展较为相关。但其对肿瘤的作用及其机制、以及在不同肿瘤发生发展中的意义等都尚待探讨。宫颈癌发病率位于女性生殖系统三大恶性肿瘤之首,直接蔓延为其最常见的播散方式,向前侵犯膀胱,向后侵犯直肠。其次,由于宫旁淋巴管丰富,淋巴转移也是其扩散的主要途径。肿瘤的扩散转移给病人带来极大的痛苦,甚至威胁生命。因此,明确宫颈癌迁移的具体机制对于降低患者病死率及改善预后具有重要意义。用基因芯片检测宫颈鳞癌和癌旁宫颈组织的差异表达基因时,发现s100a9在宫颈鳞癌中的表达更高,提示s100a9可能与宫颈癌的发生发展密切相关。因此,本研究以宫颈癌细胞为实验对象,观察s100a9对其增殖及转移的影响,并初步探讨其分子机制,为阐明宫颈癌发生发展积累实验依据,也可望为宫颈癌的诊断及治疗提供新思路。方法1.下调和上调人s100a9基因表达的工具的制备:1-1干扰人s100a9基因表达的重组腺病毒adsis100a9及其对照腺病毒adsicontrol的构建、包装:将针对人s100a9基因的干扰序列及其无关序列(对照)分别插入pses1中,然后转化bj5183,与padeasy进行重组,挑选针尖样大小单克隆菌落,提质粒,pacⅠ酶切鉴定后,将pacⅠ酶切后线性化的质粒在lipo2000辅助下转染hek293细胞,进行病毒包装。1-2用hek293细胞扩增所需重组腺病毒:包括adsis100a9、adsicontrol、携带人s100a9基因的重组腺病毒ads100a9及其对照adgfp。2.检测三株宫颈癌细胞系(siha、caski和hela)中s100a9的内源性表达;分别用ads100a9和adsis100a9感染低表达和高表达s100a9的hela和siha细胞,再用rt-pcr和蛋白质印迹法确认被感染细胞中s100a9基因表达的上调和下调。3.s100a9对宫颈癌hela和siha细胞的增殖和迁移的影响:利用ads100a9和adsis100a9分别感染hela和siha细胞,分别用mtt法、划痕愈合试验和transwell试验检测其增殖及迁移能力的变化。4.s100a9对宫颈癌细胞上皮间质转化(epithelial-mesenchymaltransition,emt)的影响:ads100a9和adsis100a9分别感染于hela和siha细胞后,蛋白质印迹法、免疫荧光检测emt标志物e-cadherin、vimentin的水平变化。5.s100a9对宫颈癌细胞中wnt/β-catenin信号活性的影响:ads100a9和adsis100a9分别感染hela和siha细胞后,rt-pcr和蛋白质印迹法检测wnt/β-catenin信号通路关键信号分子β-catenin(全部的及胞核内的)以及下游靶基因c-myc、snail和twist的表达。6.wnt/β-catenin信号通路在s100a9诱导宫颈癌细胞增殖和迁移的作用:联合使用重组蛋白gst-hs100a9和β-catenin的重组干扰腺病毒(adsiβ-catenin)处理hela细胞,经mtt法和transwell试验检测其增殖和迁移能力的变化。7.wnt/β-catenin信号通路在s100a9诱导宫颈癌细胞发生emt中的作用:联合使用重组蛋白gst-hs100a9和adsiβ-catenin处理hela细胞,蛋白质印迹法检测emt标志物e-cadherin、vimentin水平的变化。结果1.成功构建、包装和扩增实验所需的病毒。1-1构建s100a9的sirna质粒并将其转入bj5183细胞中与padeasy进行同源重组,再将重组质粒转染hek293细胞后,荧光显微镜下可见细胞中的红色荧光逐渐增强;于7-9d后收集细胞,反复冻融以裂解细胞,3次后收获adsis100a9;相同方法获得其对照腺病毒adsicontrol。至此,完成adsis100a9和adsicontrol的包装。1-2将待扩增的病毒ads100a9、adgfp和adsis100a9、adsicontrol感染hek293细胞,24、36和48小时后的hek293细胞中分别可见逐渐增强的绿色荧光和红色荧光;待80%以上细胞变圆、少数细胞脱落漂浮时收获细胞,冻融裂解,收获病毒,再进行逐轮扩增;病毒分装冻存于-20℃备用。2.这三株宫颈癌细胞系中,s100a9的表达以hela细胞最低,siha细胞略高于caski。ads100a9和adgfp感染hela细胞后,ads100a9组的细胞中s100a9mrna和蛋白水平显著高于空白组和gfp组(即adgfp感染组);adsis100a9及adsicontrol感染siha细胞后,adsis100a9组的细胞中s100a9mrna和蛋白水平显著低于空白组和sicontrol组(即adsicontrol感染组)。3.s100a9促进宫颈癌细胞的增殖和迁移。3-1s100a9促进宫颈癌细胞的增殖(mtt):1)hela细胞:按实验设计用ads100a9等处理各组细胞;第1、2d,三组细胞之间的od490nm值(od值)无明显差异;到第3d,空白组、gfp组及s100a9过表达组的od值分别为0.870±0.124、0.833±0.164和1.257±0.158,s100a9过表达组的od值显著高于gfp组(p<0.05);2)siha细胞:三组细胞在adsis100a9等相应处理后,其增殖能力在1d、2d无明显差异;到第3d,空白组、sicontrol组及s100a9干扰组的od值分别为1.190±0.206、1.113±0.179和0.683±0.066,s100a9干扰组的od值显著低于sicontrol组(p<0.05)。3-2s100a9促进宫颈癌细胞的迁移。1)hela细胞:划痕24h后,s100a9过表达组的划痕愈合能力显著高于空白组和gfp组;transwell试验结果与之一致,即:s100a9过表达组的穿膜细胞数为(128.67±22.03)个,明显高于空白组(74.67±14.05)和gfp组(66.00±14.42)个,差异具有显著性(p<0.05);2)siha细胞:划痕36h后,s100a9干扰组的划痕愈合能力明显低于空白组和sicontrol组;transwell试验结果与之一致,即:s100a9干扰组的穿膜细胞数为(77.50±7.77)个,明显低于空白组(182.5±10.61)和sicontrol组(155.50±4.94),差异具有高度显著性(p<0.01)。4.s100a9促进宫颈癌细胞emt的发生。蛋白质印迹法和细胞免疫荧光检测的结果一致显示:s100a9过表达的hela细胞内的e-cadherin水平低于gfp组(p<0.05),vimentin水平则高于gfp组(p<0.01);s100a9干扰组的siha细胞内e-cadherin高于sicontrol组(p<0.01),而vimentin水平则低于sicontrol组(p<0.05)。5.s100a9增强宫颈癌细胞中wnt/β-catenin信号活性。1)s100a9过表达的hela细胞内总的及胞核内的β-catenin水平均高于gfp组,分别是gfp组的1.43倍和2.12倍(p<0.01),并且该通路的下游靶基因c-myc、snail和twist的mrna水平也均高于gfp组(p<0.05;p<0.01;p<0.05);2)s100a9表达下调的siha细胞内总的及胞核内的β-catenin水平则低于siControl组,分别为siControl组的27%(P<0.001)和50%(P<0.05),该通路下游的c-myc、Snail和Twist的mRNA水平也均低于siControl组(P<0.01;P<0.01;P<0.001)。6.Wnt/β-catenin信号通路参与介导S100A9促进宫颈癌细胞增殖和迁移的作用。Adsiβ-catenin可下调β-catenin的表达,联合使用GST-h S100A9和Adsiβ-catenin处理Hela细胞,我们发现β-catenin的下调能够部分抑制S100A9诱导的Hela细胞增殖和迁移。7.Wnt/β-catenin信号通路参与介导S100A9促进宫颈癌细胞EMT的作用。联合使用GST-hS100A9和Adsiβ-catenin处理Hela细胞,蛋白质印迹法检测显示β-catenin的下调能够部分阻断S100A9引起的E-cadherin的下调和Vimentin的上调。结论1.S100A9促进宫颈癌细胞的增殖和迁移。2.S100A9促进宫颈癌细胞的EMT。3.S100A9激活宫颈癌细胞中的Wnt/β-catenin信号通路。4.S100A9对Wnt/β-catenin信号通路的激活作用参与介导S100A9的促宫颈癌细胞增殖、迁移和EMT的活性。