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研究背景与目的食管癌(esophageal cancer,EC)是上消化道癌中最常见的恶性肿瘤之一,组织学分型主要分为食管鳞状细胞癌和食管腺癌。我国超过90%的食管癌是食管鳞状细胞癌,死亡率高居世界首位。食管鳞状细胞癌有高侵袭性和高转移倾向,且易于向黏膜下侵袭及远处转移,预后非常差,严重危害人类的健康与生命。目前食管鳞状细胞癌的主要治疗模式以外科手术为主,放疗、化疗为辅,但长期以来患者的生存率一直没有得到明显的改善。探究食管鳞状细胞癌发病机制及寻找食管鳞癌的靶向治疗成为了医学界一项紧迫的任务。孕激素和脂联素分子受体(progestin and adipoQ receptor,PAQR)基因家族在多类物种中广泛表达,包括11个家族成员(PAQR 1~11),在生命发展进化中发挥着重要作用。已有多项研究表明,人类癌症中孕激素和脂联素分子受体3(progestin and adipoQ receptor 3,PAQR3)的表达水平下调,并与肿瘤的发生发展、患者的生存时间及预后有密切关系。此外,恢复PAQR3的表达水平可以诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖、恶性转化,抑制血管生成及肿瘤侵袭,继而影响肿瘤的发生与发展。侵袭与转移是恶性肿瘤的主要特征,同时也是导致肿瘤复发与患者死亡的关键因素。血管及淋巴管生成关系许多人类肿瘤的发生发展,尤其与肿瘤的侵袭与转移密切相关。血管及淋巴管的生成决定了肿瘤的生长、转移、复发及预后。血管的生成是肿瘤生长的基础,血液供应是肿瘤生长、迁移与浸润的前提。淋巴管在转移瘤生长早期通过弥散及运输供给肿瘤细胞营养,恶性肿瘤中心区及周围区均有淋巴管新生,在肿瘤转移过程发挥重要作用。因此,脉管的生成在肿瘤侵袭与转移过程中至关重要。随着分子生物学的不断快速发展,基因与肿瘤脉管生成关系的研究成为了研究热点与重点,为探讨肿瘤细胞增殖、恶性转化及侵袭转移机制,寻找靶向治疗提供了新的方向。PAQR3是PAQR家族新发现的成员,是一种新型的肿瘤抑制基因,在多种恶性肿瘤中表现出抑癌作用。尽管PAQR3在多种恶性肿瘤中发挥的抑癌作用已有较多报道,然而,PAQR3与肿瘤脉管生成的关系探讨尚未见报道。目前PAQR3在食管鳞状细胞癌中的表达和功能研究较少,与食管鳞状细胞癌脉管生成关系尚未见相关报道。为进一步明确PAQR3与食管鳞癌脉管生成的关系,本课题将通过采用免疫组织化学方法检测50例食管鳞状细胞癌及癌旁正常组织VEGF、VEGF-C、CD31及D2-40的表达情况;运用Western Blot方法检测人食管癌TE-1细胞与人食管正常黏膜上皮细胞中PAQR3、VEGF、VEGF-C的蛋白表达情况;采用原位杂交方法检测50例食管鳞状细胞癌及癌旁正常组织PAQR3 mRNA表达情况;运用实时荧光定量PCR技术检测人食管癌TE-1细胞PAQR3、VEGF、VEGF-C的表达情况,探讨PAQR3与食管鳞状细胞癌脉管生成的关系及其可能机制,为进一步研究PAQR3对食管鳞状细胞癌的发生、发展以及预后研究提供依据,寻求可能抑制食管鳞状细胞癌侵润与转移的方法。材料与方法1.50例食管鳞状细胞癌及癌旁正常黏膜组织蜡块选取自郑州大学第一附属医院病理科2015年1月至2015年7月标本存档蜡块;人食管鳞癌TE-1细胞系,由郑州大学医学科学院细胞信号与蛋白质组学研究中心惠赠。2.采用原位杂交技术检测50例食管鳞癌组织及50例癌旁正常食管黏膜组织中PAQR3 mRNA的表达情况。3.采用免疫组织化学方法检测50例食管鳞癌组织及50例切缘正常食管黏膜组织中VEGF、VEGF-C的蛋白表达情况;检测CD31蛋白表达计算MVD值;检测D2-40蛋白表达计算LMVD值。4.分组培养细胞:分组培养人食管癌TE-1细胞与人食管正常黏膜上皮细胞,以人食管正常黏膜上皮细胞作为对照组。5.合成全硫代修饰PAQR3正义寡核苷酸(sense oligodeoxynucleotide,SODN)、PAQR3反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN),以全硫代修饰无义寡核苷酸(nonsense oligodeoxynucleotide,NODN)作为对照(探针均由上海吉玛制药技术有限公司合成)。6.分组转染人食管正常黏膜上皮细胞与人食管癌TE-1细胞,运用Western Blot方法,检测各组细胞PAQR3、VEGF及VEGF-C蛋白表达情况。7.分组转染人食管癌TE-1细胞,采用实时荧光定量PCR技术检测各组细胞中PAQR3 mRNA、VEGF mRNA及VEGF-C mRNA表达情况。8.统计学处理:使用SPSS 17.0统计软件处理实验数据,符合正态分布的计量资料,统计分析采用均数±标准差(X±S)表示;计量资料均数间的比较采用阳性率的比较采用χ~2检验、t检验或方差分析(one-way ANOVA);以α=0.05为显著性检验水准。结果1.食管鳞状细胞癌组织中PAQR3 mRNA阳性表达率明显低于癌旁正常组织,两者相比较,差异具有统计学意义(P<0.001)。2.食管鳞状细胞癌组织中VEGF、VEGF-C蛋白阳性表达率明显高于癌旁正常组织,两者相比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。3.食管鳞状细胞癌组织中MVD、LMVD值显著高于癌旁正常组织,两者相比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。4.食管鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织中VEGF的表达与MVD呈正相关(P<0.001)。5.食管鳞状细胞癌组织及癌旁正常组织中VEGF-C的表达与LMVD呈正相关(P<0.001)。6.食管癌TE-1细胞转染硫代修饰PAQR3正义寡核苷酸链后PAQR3蛋白表达明显高于无义链组(P<0.05),同时VEGF、VEGF-C蛋白表达均明显低于无义链组(P<0.05);食管癌TE-1细胞转染硫代修饰PAQR3反义寡核苷酸链后PAQR3蛋白表达明显低于无义链组(P<0.05),同时VEGF、VEGF-C蛋白表达均明显高于无义链组(P<0.05)。正常食管癌黏膜上皮细胞转染硫代修饰PAQR3正义寡核苷酸链后PAQR3蛋白表达明显高于无义链组(P<0.05),同时VEGF、VEGF-C蛋白表达均明显低于无义链组(P<0.05);正常食管癌黏膜上皮细胞转染硫代修饰PAQR3反义寡核苷酸链后PAQR3蛋白表达明显低于无义链组(P<0.05),同时VEGF、VEGF-C蛋白表达均明显高于无义链组(P<0.05)。7.食管癌TE-1细胞转染硫代修饰PAQR3正义寡核苷酸链后PAQR3 mRNA表达明显高于无义链组(P<0.01),食管癌TE-1细胞转染硫代修饰PAQR3反义寡核苷酸链后PAQR3 mRNA表达明显低于无义链组(P<0.01)。8.食管癌TE-1细胞转染硫代修饰PAQR3正义寡核苷酸链后VEGF mRNA、VEGF-C mRNA表达明显低于无义链组(P<0.01);转染硫代修饰PAQR3反义寡核苷酸链后VEGF mRNA、VEGF-C mRNA表达明显高于无义链组(P<0.01)。9.食管癌细胞中PAQR3蛋白表达与VEGF、VEGF-C蛋白表达均呈负相关(P<0.01)。结论1.PAQR3低表达可能与食管鳞状细胞癌发生发展有关。2.PAQR3可能通过调控VEGF、VEGF-C表达影响食管鳞状细胞癌脉管形成。