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肝纤维化是各种慢性肝病导致的肝细胞弥漫性损伤的一种常见病理结果,其特征是胶原、糖蛋白等细胞外基质（ECM）成分的过度累积和异常分布。肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSCs）的活化是肝纤维化发生发展进程中最重要的环节。抑制HSCs增殖、诱导细胞凋亡和衰老是防治肝纤维化对的潜在治疗方法。肝纤维化的自发性恢复包括ECM蛋白的降解、活化的HSCs凋亡和肝细胞的再生,而活化的HSCs凋亡在纤维化逆转过程中扮演着关键角色。因此,调控活化HSCs的凋亡可能有助于治疗治疗肝纤维化。在肝纤维化恢复期,肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL）可有效诱导活化的HSCs凋亡,对正常的HSCs没有影响。因此,提高TRAIL诱导活化HSCs凋亡的敏感性可能有助于治疗肝纤维化。Micro RNAs（miRNAs）是一类大小为19-25个核苷酸的内源性非编码小RNA,参与多种肝脏疾病的发生发展,包括肝纤维化、肝硬化、肝癌等。miR-145作为广泛认知的肿瘤抑制因子,在肝纤维化、肝炎、肝细胞癌中也扮演着重要的角色。本课题组前期研究表明,miR-145通过靶向ZEB2抑制HSCs的活化和增殖,限制肝纤维化的进一步发展。然而,miR-145是否参与肝纤维化病程中TRAIL诱导的活化HSCs的凋亡尚未阐明。LncRNAs（long non-coding RNA,lnc RNA）是一类转录本长度超过200 nt的RNA分子,通过竞争性内源性RNA调控miRNA的浓度和生物学功能。生物信息学预测发现miR-145可能与linc-ROR直接结合,并且预测存在三个可能结合位点。但linc-ROR/miR-145在TRAIL诱导的活化HSCs凋亡中的具体作用尚不清楚。本研究旨在探讨linc-ROR/miR-145/ZEB2对TRAIL诱导的活化HSCs凋亡的影响及可能的机制。研究内容如下:1.miR-145、ZEB2和linc-ROR在肝纤维化中的表达体内体外检测miR-145,ZEB2和linc-ROR的表达变化,结果表明miR-145的表达显著降低,而linc-ROR和ZEB2表达显著升高。2.miR-145对TRAIL诱导的活化LX-2细胞凋亡的影响转染miR-145 inhibitor或miR-145 mimics的LX-2细胞,凋亡结果显示:TRAIL提高了活化LX-2细胞的凋亡率;沉默miR-145显著降低了TRAIL处理的活化LX-2细胞的凋亡率和cleaved caspase-3蛋白水平,增加了α-SMA和col-I的水平;而过表达miR-145反之。3.miR-145靶向ZEB2对TRAIL诱导活化LX-2细胞凋亡的影响生物信息学预测发现ZEB2是miR-145的潜在靶点。使用ZEB2-siRNA和ZEB2-OE转染LX-2细胞,流式细胞术和Western blot检测结果显示:TRAIL可明显提高TGF-β1处理的LX-2细胞的凋亡率;过表达ZEB2可降低TRAIL对细胞凋亡率及cleaved caspase-3蛋白水平的影响,促进Col.I和α-SMA的蛋白表达;沉默ZEB2反之。双荧光素酶报告基因实验结果显示:miR-145 mimics和ZEB2野生型荧光质粒（ZEB2-WT）共转染能明显降低LX-2中ZEB2的相对荧光表达量。用miR-145mimics或miR-145 inhibitor以及相应的阴性对照对LX-2进行转染,结果miR-145mimics可抑制活化的LX-2细胞中ZEB2 mRNA及蛋白水平表达,而miR-145inhibitor能促进ZEB2 mRNA及蛋白的表达。进一步验证了miR-145和ZEB2靶向关系。Western blot进一步检测miR-145是否通过靶向ZEB2增强TRAIL诱导的活化的LX-2细胞凋亡,结果显示,与miR-145 inhibitor组比较,在共转染miR-145inhibitor和ZEB2-siRNA的LX-2细胞中,cleaved caspase-3蛋白水平显著升高。4.ZEB2对TRAIL诱导活化LX-2细胞凋亡中NF-κB活性的影响转录因子NF-κB的激活在HSCs凋亡中起关键作用。我们使用ZEB2-siRNA或ZEB2-OE处理LX-2细胞,Western blot结果表明,转染ZEB2-siRNA后,TRAIL诱导活化的LX-2细胞中phospho-IκBα和phospho-p65蛋白水平显著升高。相比之下,过表达ZEB2后,phospho-IκBα和phospho-p65的蛋白水平降低。提示ZEB2可能通过NF-κB信号通路介导TRAIL诱导活化LX-2细胞凋亡。5.linc-ROR/miR-145/ZEB2对TRAIL诱导的活化HSCs凋亡的影响通过生物信息学分析发现miR-145是linc-ROR的潜在靶标。我们使用TGF-β1（10 ng/ml）和TRAIL（10 ng/ml）处理转染linc-ROR-siRNA或linc-ROR-OE的LX-2细胞。Western blot结果显示:沉默linc-ROR显著促进TRAIL处理活化LX-2细胞的凋亡率和cleaved caspase-3蛋白水平,降低α-SMA和Col.I水平;过表达linc-ROR反之。转染linc-ROR-siRNA或linc-ROR-OE的LX-2细胞,qRT-PCR检测miR-145的表达,结果表明沉默linc-ROR可显著提高miR-145表达;而过表达linc-ROR可显著抑制miR-145表达。流式细胞术检测凋亡,结果显示:沉默linc-ROR显著提高了TRAIL处理的活化LX-2细胞的凋亡率,而过表达linc-ROR显著降低了TRAIL处理的活化LX-2细胞的凋亡率。使用TGF-β1（10 ng/ml）和TRAIL（10 ng/ml）处理共转染miR-145 mimics和linc-ROR-OE的LX-2细胞,Western blot检测cleaved caspase-3的表达,结果表明,与过表达linc-ROR相比,同时过表达linc-ROR和miR-145可明显促进TRAIL处理的活化LX-2细胞的凋亡率和cleaved caspase-3蛋白水平。以上结果表明:在肝纤维化病程中linc-ROR通过miR-145/ZEB2下调TRAIL诱导的活化LX-2细胞凋亡的敏感性。