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在女性生殖系统恶性肿瘤中,子宫颈癌(cervical cancer)发病率居于首位,是最常见的妇科恶性肿瘤,即使在女性全身各系统恶性肿瘤中,其发病率也仅次于乳腺癌。由于宫颈癌的发病和HPV感染、社会经济状况等密切相关,所以每年约50万新病例多数是在发展中国家,我国约占其中的1/3。近年宫颈癌的发病呈年轻化趋势,35岁以下的妇女宫颈癌的发病率明显上升。对于发现及时的早期宫颈癌患者,适时进行相应的手术治疗,尚能收到不错的临床预后,但是对于比较年轻的宫颈早期癌患者,经传统手术治疗后,阴道、宫颈和子宫等生殖器官解剖结构和功能均受到的不同程度的破坏,使患者的性功能与生育能力受到影响。寻找一种既能够有效治疗宫颈癌,同时又能尽量最大程度保护患者性功能和生殖能力的治疗手段(Fertility-Sparing Therapy),一直是医患双方的共同期盼。脉冲电场(Pulsed Electric Fields;PEF)是近年来兴起的一种新型的肿瘤物理治疗方法。通过调节电场中脉冲频率(Frequency)、脉冲个数(Pulses)、脉冲波宽度(Pulse Width)、电场强度/电压(Electric Field Strength/Voltage)等参数,可以生成能发挥不同生物学作用的PEF。其中,脉宽在μs级、场强达~k V/cm的一种PEF,可以使细胞表面的磷脂分子重排,细胞膜上亲水性通道形成,微孔无法恢复,对细胞膜造成永久性的损伤,即在电场作用后细胞膜呈高通透状态,继而细胞因为膜内外生物大分子、离子等物质失衡而死亡,这就被称为细胞的不可逆性电穿孔(Irreversible Electroporation;IRE)。基于IRE技术的肿瘤物理治疗仪器“纳米刀”系统(Nano Knife?System;Angio Dynamics,NY,USA)已于2011年10月获美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration;FDA)批准应用于临床治疗软组织肿瘤。课题组前期研究表明,IRE体外处理He La细胞,发生不可逆性电穿孔而早期坏死的阈值场强为1750V/cm。国内外众多研究也证实,IRE对实体肿瘤的疗效确切,现已应用于胰腺癌、肝癌、肾癌、前列腺癌、黑色素瘤及软组织肿瘤等实体肿瘤的治疗,且疗效确切,是失去手术机会的肿瘤、或解剖关系复杂手术风险大的肿瘤的二线替代方案之一。IRE通过电极针布阵和调节电场参数,治疗范围精确可控;治疗时间短,数分钟便可完成治疗;且其疗效不依赖于热效应,不受血流的影响。被认为是近年来肿瘤物理治疗领域当中非常具有应用前景的技术方法之一。IRE的杀伤效应虽然与射频消融(Radiofrequency ablation;RFA)、激光等方法不同,不依赖于热效应,但是IRE作用时随着电场衰减,周边残瘤组织会受到相对低能量的脉冲电场作用,这种作用对肿瘤细胞恶性行为可能存在潜在的影响。已有研究表明,RFA治疗后,如有残留肿瘤存在,其可能促进残存肿瘤病灶细胞的增殖、肿瘤复发及转移等。IRE消融是否也会出现类似情况呢?如果确有促进作用,那么该如何避免或者处理呢?是否应行超范围消融治疗?这些问题在IRE治疗研究领域至今未见相关报道。因此,本课题构建萤火虫荧光素酶基因(Firefly Luciferase;FLUC)和绿色荧光蛋白基因(Green fluorescent protein;GFP)双标记的He La细胞系,以此定量分析裸鼠荷瘤模型的残留肿瘤,进而探索IRE后残留肿瘤生物学行为的变化。同时,在IRE周围区域存在RE区域,对于难以避免的残留肿瘤组织,我们拟充分利用该RE区域,探索IRE结合基因治疗宫颈癌裸鼠模型的可行性。本课题主要分为以下三个部分进行研究。第一部分LUC/GFP双标记宫颈癌He La细胞株的构建及筛选目的:构建LUC/GFP双报告基因标记的He La细胞株;方法:将PCR扩增得到的LUC基因连接到含有GFP报告基因的GV218慢病毒载体中,构建LUC/GFP双标记的重组质粒;将经测序验证、正确构建的重组质粒,通过转染、病毒包装及提纯等步骤,收获一定滴度的病毒原液;用构建的LUC/GFP双标记慢病毒转He La细胞,利用载体上的抗性基因,用嘌呤霉素加压筛选稳定转染的LUC/GFP-He La细胞株;采用CCK-8、PI染色测定细胞周期及Westernblot等方法检测病毒转染是否影响He La细胞的生物学行为。结果:构建LUC/GFP双标记的慢病毒,经荧光法测定慢病毒滴度为2.0×109TU/ml;经病毒转染及加压筛选后,成功构建LUC/GFP-He La稳定转染细胞株,通过CCK-8、PI染色测定细胞周期及Western blot等方法检测,病毒转染后未改变He La细胞生物学行为。结论:成功构建LUC/GFP双标记的慢病毒,经病毒转染及加压筛选后,成功构建LUC/GFP-He La稳定转染细胞株,且转染后的细胞生物学行为无明显变化,可用于构建动物模型进行下一步研究。第二部分IRE后宫颈癌裸鼠模型残留肿瘤生物学行为的变化目的:初步探讨IRE消融宫颈癌裸鼠模型后残留肿瘤生物学行为的变化;方法:使用组织包埋法构建皮下移植瘤模型;利用活体动物成像技术,探索不同场强的IRE形成残留肿瘤组织的量效关系;使用光声成像技术测定IRE处理后即刻肿瘤组织内血液供应情况;设立假手术组、手术切除组与IRE组进行对照研究,使用活体动物成像技术动态检测残余肿瘤组织的荧光强度,进行定量分析;留取处理前、处理后10天及处理后20天组织样本,使用Western blot检测样本中与增殖、侵袭和转移相关蛋白PCNA、VEGF、MMP-9等蛋白的变化。结果:使用2000V/cm、100μs、1Hz、15个脉冲剂量的IRE可使荷瘤裸鼠模型残留部分(53.22±6.28)%肿瘤组织;光声成像显示该剂量IRE下留存的部分肿瘤组织内有血液供应;活体动物成像荧光强度定量分析显示,IRE及手术组处理后24小时,荧光强度分别降低(53.67±5.22)%及(51.81±4.39)%,假手术组无明显变化,与预期相符;处理后10天,手术组荧光强度较IRE组显著增加(P<0.05);处理后20天,三组荧光强度差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot检测肿瘤相关蛋白结果显示,处理后10天,IRE组PCNA表达明显低于其他两组(P<0.05),VEGF、E6、MMP-9等无明显差异(P>0.05);处理后20天三组中上述蛋白均无明显差异。结论:使用IRE可使荷瘤裸鼠模型残留部分肿瘤组织,用于下一步研究。IRE处理后短期内在一定程度上可抑制残留肿瘤的增殖,对残留肿瘤的转移、侵袭等无明显影响。第三部分IRE介导干扰质粒治疗残留肿瘤的可行性研究目的:初步探讨IRE在体外及体内介导干扰质粒进入He La细胞的可行性,以及二者联合对He La细胞的影响。方法:将HPV18 E6基因特异性干扰序列构插入p Genesil-1质粒,构建HPV 18 E6 sh RNA真核表达载体;IRE联合干扰质粒处理He La细胞株,设立空白对照组、IRE处理组、p Genesil-N组、p Genesil-N+IRE组、p Genesil-E6组及和p Genesil-E6+IRE组共6组,使用PCR、Western blot及CCK-8等方法探讨联合处理对He La细胞增殖等生物学行为的影响;IRE联合干扰质粒处理裸鼠皮下瘤,48小时后,使用HE染色了解IRE杀伤效应,以及快速冰冻切片了解GFP表达情况;设立假处理组、IRE组、质粒组及IRE+质粒组共4组,处理后定期测量肿瘤体积,了解残留肿瘤生长曲线,使用Western blot法检测肿瘤增殖、侵袭及转移相关蛋白的表达情况。结果:成功构建HPV 18 E6 sh RNA真核表达载体;IRE可介导质粒进入He La细胞,处理后48小时即可见GFP表达;IRE处理联合干扰质粒处理He La细胞后,与IRE组比较:E6 m RNA表达水平显著下降(P<0.05),Western blot提示E6蛋白表达水平降低(P<0.05),P53蛋白表达水平增高(P<0.05)、PCNA表达水平下降(P<0.05);CCK-8法提示:与单纯干扰质粒转染组比较,IRE联合质粒处理组细胞增殖活性下降更明显(P<0.05);HE染色证实所用剂量IRE可致裸鼠皮下瘤部分坏死,残存部分肿瘤组织;快速冰冻切片显示,残留肿瘤内可见GFP表达;Western blot提示IRE联合质粒可显著抑制残留肿瘤增殖,对侵袭转移等无明显影响。结论:IRE在体内外均可介导质粒进入He La细胞,且联合处理可显著抑制He La细胞和残余肿瘤的增殖。IRE联合干扰质粒可作为预防肿瘤残留的一种新策略。