论文部分内容阅读
Alzheimer’s病（AD）是神经系统变性疾病,表现为学习、记忆能力下降,智能减退,生活自理能力降低。由于社会老龄化,AD成为老年人继心脏病、肿瘤和卒中之后的第四位死亡原因。AD患者智能下降,生活自理能力逐渐丧失,在治疗和护理上耗费大量的精力和费用,给家庭和社会带来沉重的经济压力。AD的特征性病理改变是老年斑（SP）、神经原纤维缠结（NFT）、神经元颗粒空泡变性、脑血管淀粉样变性等。由于AD的确切病因和发病机制并不完全清楚,因而在临床缺乏对AD明确有效的治疗措施。近年来的研究表明,大脑局部过度的炎性反应引起大量的细胞因子释放,在AD的发生和发展中起重要作用。炎性反应同老年斑和神经原纤维缠结为AD的主要特征。针对AD的病理特点,我们认为阻断AD的炎性反应是一治疗靶点。β-淀粉样蛋白（Aβ）可激活小胶质细胞导致炎性细胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的分泌增加,小胶质细胞分泌的IL-1β又刺激星形胶质细胞活化,活化的星形胶质细胞进一步分泌炎性细胞因子,加重Aβ的沉积,从而形成“恶性循环”,导致神经元和突触的不可逆损害,出现神经病理和临床改变。人们开始用非甾体抗炎药（NSAIDs）治疗AD。研究表明,长期应用NSAIDs可以降低AD发病的危险性并可缓解AD的症状。故抗炎治疗可以延缓AD的发生,缓解AD的临床症状。研究证实烟碱可抑制机体的炎性反应。给实验动物注射烟碱,炎性反应减轻。有学者经过流行病学研究,提出吸烟可降低AD发病的危险性。给AD患者使用烟碱透皮贴剂,认知功能得到改善。烟碱在中枢神经系统的受体是胶质细胞、神经元表面的α7nAChR,胶质细胞是中枢神经系统内分泌炎性介质的主要细胞。我们这项研究的目的是探讨在AD大鼠内,烟碱作用于胶质细胞表面的α7nAChR对抗Aβ引起的炎性反应,研究烟碱对AD大鼠认知功能改善的作用机制。我们给予AD模型大鼠口服烟碱,通过Morris水迷宫实验,并检测α7nAChR、IL-1β、IL-6等的变化,观察烟碱对AD大鼠认知功能的改善作用,探讨烟碱的作用机制。在海马神经组织细胞混合培养体系中加入烟碱和Aβ25-35,检测炎性细胞因子IL-1β、IL-6变化,探讨Aβ25-35对神经元的损害作用,烟碱的抗炎效应和对神经细胞的保护作用。主要研究内容和结果:1.烟碱对AD大鼠海马炎性反应的作用动物实验分三组,烟碱AD组、AD对照组、正常对照组。给予S-D大鼠口服烟碱,然后在大鼠双侧海马区注射Aβ25-35,建立烟碱AD大鼠模型。给S-D大鼠双侧海马区注射Aβ25-35,建立AD大鼠模型。通过Morris水迷宫实验,检测烟碱AD组、AD组大鼠和正常对照组大鼠学习记忆能力的变化。烟碱AD组大鼠在平台定位航行实验中潜伏期较正常对照组有所延长,在平台象限的游泳时间百分比和游泳距离百分比较正常对照组降低,但高于AD对照组,差异明显。AD组大鼠平台定位航行实验潜伏期虽有下降趋势,但不稳定,在平台象限搜索次数较少,目的性不明确,与烟碱AD组、正常对照组相比差异明显。对三组动物进行方差分析,差异具有显著意义。对海马组织α7nAChR蛋白含量进行检测,AD组第1天、第7天、第15天α7nAChR蛋白明显下降,与正常对照组相比,差异显著。烟碱AD组第1天、第7天、第15天下降,但下降幅度不如AD组明显,与AD组相比,存在差异;与正常组相比,无差异。AD组海马组织IL-1β、IL-6在1-15天明显升高,第7天达峰值,第15天仍明显高于正常对照组。烟碱AD组IL-1β、IL-6升高,但与AD组相比,升高幅度不大,存在显著性差异;与正常对照组相比,存在差异。α7nAChR免疫染色阳性细胞:α7nAChR免疫染色阳性物质位于细胞膜和细胞突起。正常对照组α7nAChR免疫阳性物质染色深,阳性细胞排列规则、密集。烟碱AD组,α7nAChR免疫阳性物质染色较深,阳性细胞排列比较有规则,接近正常对照组。AD组α7nAChR免疫染色略浅,阳性细胞排列欠规则。IB4免疫染色阳性小胶质细胞:IB4免疫染色阳性物质位于整个细胞区域。正常对照组海马区IB4免疫染色阳性细胞数目少、染色浅,胞体扁长,分支细、短;烟碱AD组:海马区IB4阳性细胞数较正常组增多,染色浅,胞体形态与正常组类似;AD组:海马区IB4免疫染色阳性细胞数目明显增多,胞体增大,突起增长增粗,部分IB4阳性细胞呈灌木样或杆状。GFAP免疫染色阳性星形胶质细胞:GFAP免疫染色阳性物质位于整个细胞区域。正常对照组海马区GFAP免疫染色阳性细胞数目少,染色淡而均匀,胞体小,突起细短;烟碱AD组海马区GFAP免疫染色阳性细胞数目增多,染色加深,部分细胞胞体增大,突起增长;AD组海马区GFAP免疫染色阳性细胞明显增多,胞体增大,突起增长增粗。IL-1β免疫染色阳性细胞:IL-1β免疫染色阳性物质主要位于细胞体。正常对照组、烟碱AD组大鼠海马区IL-1β免疫染色阳性物质反应弱,染色浅。AD组海马区域IL-1β免疫染色阳性增强,阳性细胞增多。2、烟碱抗Aβ25-35神经毒性作用研究用2d龄Sprague-Dawley大鼠海马神经组织细胞混合培养体系。实验分为:正常对照组、Aβ（2μM）组、烟碱（10μM）+Aβ（2μM）组、烟碱（20μM）+Aβ（2μM）组。无菌分离海马组织,培养海马神经组织细胞混合体系,到第5天,在相差显微镜下观察,培养细胞生长良好,细胞扁平,神经元四周出现明显光晕,胞体增大,突起长出并逐渐伸长,部分联成网络。分别按10μM、20μM浓度加入烟碱,孵育1h后加入Aβ（2μM）,再孵育24小时。检测细胞培养上清液IL-1β、IL-6含量,测定神经元胞体直径和突起长度及细胞生存率。烟碱Aβ组细胞培养上清液中IL-1β、IL-6含量增高,烟碱浓度10uM时细胞培养上清液中IL-1β、IL-6含量与正常对照组相比差异明显,而烟碱浓度在20uM时细胞培养上清液中IL-1β、IL-6含量与正常对照组相比差异不明显。烟碱Aβ组两种浓度下,细胞培养上清液中IL-1β、IL-6含量与Aβ组相比,差异显著。神经元荧光染色,正常对照组神经元胞体饱满,细胞轮廓圆滑,神经突起形成网络联系;烟碱Aβ组,神经元细胞形态接近正常,神经元胞体直径和突起长度与正常组相差不明显;Aβ组,神经元数目减少,部分细胞脱离底壁而漂浮,损伤神经元逐渐退化、崩解,出现沉淀,神经突起断裂,神经元胞体直径增大,胞体肿胀,突起回缩。烟碱（10μM）+Aβ（2μM）组、烟碱（20μM）+Aβ（2μM）组细胞存活率分别为54.7%、62.27%。而Aβ组细胞存活率只有29.57%。烟碱具有抗Aβ神经毒性,提高细胞生存率,保护神经元的作用。结论大鼠口服烟碱后,在其双侧海马区注射Aβ25-35,成功建立了烟碱AD大鼠模型。在Morris水迷宫实验中,烟碱AD组大鼠平台定位航行实验的潜伏期比正常对照组有延长,但比AD大鼠明显缩短;在空间探索实验中,烟碱AD组大鼠平台象限游泳时间百分比、游泳距离百分比较AD组大鼠明显增高。证实烟碱可改善AD大鼠认知功能。烟碱AD组与AD组比较,海马小胶质细胞和星形胶质细胞的活性降低,IL-1β、IL-6分泌减少,α7nAChR下降不明显。在α7nAChR介导下,烟碱抑制了胶质细胞的炎性细胞因子IL-1β、IL-6分泌,烟碱有明显的抗炎效应,烟碱对神经元具有保护作用。在海马神经组织细胞混合培养体系中证实烟碱可对抗Aβ25-35的细胞毒性作用。烟碱预处理后,抑制了Aβ25-35诱导胶质细胞分泌IL-1β、IL-6的作用,Aβ25-35对神经元的细胞毒性作用降低,细胞生存率提高。