【摘 要】
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布鲁氏菌病是世界普遍公认的危害严重的人畜共患病之一。传统布鲁氏菌病原学检测方法阳性率低,操作危险性高,而当前在用的血清学检测技术,其灵敏度、特异性均存在一定的局限性,此外血清学检测样本类型有限,更无法对环境中的布鲁氏菌进行监测。因此,开发一种对人畜及其生存环境、动物制品等潜在的传染源进行快速、灵敏、准确的布鲁氏菌及型别监测的检测方法,可以为布鲁氏菌病的防控提供有力的支持。方法:本文以高灵敏特异荧光
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布鲁氏菌病是世界普遍公认的危害严重的人畜共患病之一。传统布鲁氏菌病原学检测方法阳性率低,操作危险性高,而当前在用的血清学检测技术,其灵敏度、特异性均存在一定的局限性,此外血清学检测样本类型有限,更无法对环境中的布鲁氏菌进行监测。因此,开发一种对人畜及其生存环境、动物制品等潜在的传染源进行快速、灵敏、准确的布鲁氏菌及型别监测的检测方法,可以为布鲁氏菌病的防控提供有力的支持。方法:本文以高灵敏特异荧光PCR检测技术为基础,通过对布鲁氏菌属单拷贝基因Bcsp31基因设计引物探针,以线粒体16S基因内哺乳动物间相对保守的序列作为内标设计引物探针,建立布鲁氏菌属荧光定量PCR检测方法。又选用牛种布鲁氏菌ALk B/IS711部分序列,以及羊种布鲁氏菌BMEI1162/IS711部分序列设计引物及探针,建立牛、羊种布鲁氏菌荧光PCR鉴别方法。分别对属、种两个反应体系及条件进行优化,最后验证其灵敏度、特异性及重复性,并做标准曲线。最后通过实际样本对两个反应体系进行验证。结果:1.建立并优化了布鲁氏菌属荧光PCR检测方法本次实验建立了布鲁氏菌属荧光定量PCR检测体系,以质粒标准品的拷贝数的对数为横坐标,以Ct值作为纵坐标,得到标准曲线为Y=-3.459（lgx）+46.962,相关系数R~2为0.999。反应体系对与人畜布鲁氏菌病密切相关的牛种、羊种、猪种布鲁氏菌均有明显的扩增,其检测限可低至约550copies/m L。与结核分枝杆菌、伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、耶尔森氏菌等无交叉反应,反应体系拥有较好的特异性。线性范围为1010-10~4copies/m L,线性范围内批间重复性与批内重复性均小于2%,反应体系具有较好的重现性。2.将哺乳动物线粒体16s基因作为内标,用于质控PCR反应。除人源性样本外,其对牛、羊、猪、犬、鼠均有明显扩增。此外,对于全血、血清、粪便、尿液、唾液、阴道分泌物、精液、乳汁样本提取的核酸也均有明显扩增反应。因此,该内标可有效监控人畜布鲁氏菌样本核酸的提取与PCR反应,避免由于反应抑制物及未提取出核酸等原因造成的结果假阴性。3.建立并优化了布鲁氏菌牛、羊种荧光PCR鉴定方法本次实验成功建立了布鲁氏菌牛、羊种荧光定量PCR检测体系,其中牛种布鲁氏菌标准曲线为Y=-3.301（lgx）+45.602,相关系数R~2为0.998;羊种布鲁氏菌标准曲线为Y=-3.157（lgx）+46.583,相关系数R~2为0.99。牛、羊种布鲁氏菌检测下限分别达到约600copies/m L和700copies/m L,线性范围为10~9-10~4copies/m L,且线性范围内各浓度重复性CV值均小于2.1%,具有良好的重现性。反应体系与前述布鲁氏菌阴性参考菌无交叉反应。其中羊种只对羊种布鲁氏菌有特异性扩增,对牛种、猪种均无特异性反应;牛种只对牛种布鲁氏菌有特异性扩增,对羊种、猪种均无特异性反应。反应体系拥有较好的特异性。4.将反应体系用于实际样本检测,共检测263份临床疑似布鲁氏菌病患者全血样本,其中布鲁氏菌荧光PCR阳性64例。将布鲁氏菌属检测结果与虎红平板凝集试验＆试管凝集试验（布鲁氏菌病确诊标准）进行比较,两者无统计性差异。5.对样本进行牛、羊种布鲁氏菌荧光PCR检测,共检出63例羊种布鲁氏菌,1例牛种布鲁氏菌,其阳性样本主要为羊种布鲁氏菌感染,与布鲁氏菌分种检测AMOS-PCR方法比较,结果基本一致。结论:本实验建立了一种可对人畜样本直接进行布鲁氏菌检测的荧光PCR检测方法,对于后续布鲁氏菌荧光PCR检测试剂盒的开发建立了基础,此外还可以对牛、羊种布鲁氏菌进行鉴定,该方法快速、灵敏、特异,且相对安全,有良好的应用前景。
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