研究背景创伤性颅脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）致死、致残率高,是全球性的公共卫生问题。TBI包括原发性损伤和继发性损伤,其中继发性脑损伤与TBI后出现蛋白编码基因表达的改变、调节各种病理生理过程有关,包括神经兴奋性毒性、氧化应激、神经炎症、细胞凋亡等。虽然TBI的病理生理研究取得了快速的发展,但是其潜在的分子机制尚不完全清楚。TBI后基因组学的研究是颅脑创伤走向精准医疗的重要方向之一。近年来,长链非编码RNA（long non-coding RNA,lncRNA）逐渐被发现能够在表观遗传学修饰、转录和转录后翻译等水平上与DNA、RNA和蛋白质结合,在中枢神经系统损伤中扮演着多种复杂的角色,并可能成为诊断、评估、治疗和预后的生物标志物。然而目前围绕lncRNAs与TBI的研究还相对较少,lncRNA具体参与TBI的发生发展过程也尚不完全清楚。针对lncRNAs和TBI的研究能够从基因组学角度进一步阐明继发性脑损伤的病理生理机制,也有助于研发特异性的靶向药物。研究目的（一）鉴定和筛选TBI后差异表达的lncRNAs,mRNAs和miRNAs,并进行生物信息学分析;（二）构建氧化应激神经细胞模型,明确特定lncRNAs在体外模型中的表达情况;（三）明确lncRNA-TBIAT调控神经细胞氧化应激及细胞凋亡的作用机制。研究方法（一）大鼠TBI后皮层组织lncRNAs、mRNAs和miRNAs的表达改变将16只SD大鼠随机分为TBI组（n=8）和对照组（n=8）。麻醉后,用液压打击模型装置构建大鼠TBI模型。损伤后取大鼠左侧皮层组织,其中TBI组和对照组各取4个样本抽提RNA进行高通量测序;其余样本在-80℃冰箱保存后,用于q PCR验证。取适量大鼠左侧皮层组织样品,抽取总RNA。将RNA片段化、纯化及文库质检,进行PCR扩增,使用Illumina测序仪进行测序。测序数据数据进行处理和基因组比对,鉴定lncRNAs,mRNAs和miRNAs表达谱。根据p值小于0.05且差异倍数大于2的筛选条件鉴定差异表达的lncRNAs,mRNAs和miRNAs。挑选差异表达基因进行荧光定量PCR验证是否跟测序结果一致。进一步通过GO和KEGG富集分析,对差异基因的功能进行描述。构建lncRNAs-mRNAs共表达网络、lncRNAs-miRNAs-mRNAs互作网络以及lncRNA与转录因子关联网络,综合分析差异表达的lncRNAs在TBI中的调控作用。（二）TBI后凋亡变化及特定lncRNAs在氧化应激细胞模型中的表达大鼠TBI后行Western blot检测凋亡标志蛋白的变化。用H₂O₂诱导大鼠神经细胞株（PC-12,Manassas,VA,USA）构建体外模型,分别设100μmol/L,200μmol/L,400μmol/L H₂O₂处理组。采用CCK-8实验筛选H₂O₂有效作用浓度。处理氧化应激模型细胞0,3,6,12,24 h后,通过试剂盒检测过氧化氢酶（CAT）、活性氧（ROS）,超氧化物歧化酶（SOD）含量,进行氧化应激水平的检测。在确定了最合适的H₂O₂的浓度以及处理的最佳时间后,通过q PCR检测特定的lncRNAs在氧化应激细胞模型中的表达水平。把在体内和体外均差异表达的lncRNA NONRATT017220.2命名为lncRNA-TBIAT,利用Targetscan数据库与miRTar Base数据库预测可能调控的miRNAs,以便于进一步机制验证。（三）lncRNA-TBIAT调控神经细胞氧化应激及凋亡的作用机制研究PC-12细胞用于细胞转染实验研究。设置正常对照组,阴性对照组,siRNA干扰组。转染前需准备质粒,待细胞生长达60%融合时转染siRNA-lncRNA-TBIAT。q PCR验证siRNA-lncRNA-TBIAT的干扰效果,接着CCK-8检测敲低lncRNA-TBIAT后对细胞活性的影响。利用流式细胞术检测细胞凋亡情况,接着通过荧光显微镜检测ROS水平,通过CAT和SOD活性检测试剂盒检测CAT和SOD的活性的变化。通过双荧光素酶报告和AGO2实验检测lncRNA-TBIAT是否吸附miR-124-3p。敲低lncRNA-TBIAT后检测miR-124-3p的inhibitor和mimic对氧化应激细胞模型中lncRNA-TBIAT表达调控作用、细胞活性、细胞凋亡和氧化应激的影响。利用双荧光实验,验证miR-124-3p与基因Pim-1的靶向结合,并通过Western blot实验检测miR-124-3p对Pim-1蛋白的表达的调控作用。研究结果（一）大鼠TBI后皮层组织lncRNAs、mRNAs和miRNAs的表达根据为p<0.05且差异倍数大于2的筛选差异条件,筛选出的差异lncRNA数量为464,其中上调和下调的基因数量分别是249和215。检测到的差异基因mRNAs数量为537个,其中上调和下调的基因数量分别是467和70。所检测到的差异miRNA数量为25,其中上调和下调的基因数量分别是5和20。各挑选了6个lncRNA、mRNA和miRNA进行定量q PCR分析,表达趋势与测序结果一致。GO和KEGG通路分析差异性的基因可能与JAK-STAT信号通路以及氧化应激、炎症反应等多种病理生理过程有关。根据差异表达的lncRNAs,miRNAs和mRNA构建了lncRNAs-mRNAs共表达网络、lncRNAs-miRNAs-mRNAs互作网络以及lncRNA与转录因子关联网络,表明了差异表达的lncRNAs通过不同方式在TBI中的调控作用。（二）TBI后细胞凋亡变化及特定lncRNAs在氧化应激细胞模型中的表达根据TBI后大鼠皮层组织不同时间Western blot检测结果,Caspase1、Caspase3、Cleaved-Caspase3、Bax的表达水平整体趋势呈时间依赖性升高。200μmol/L浓度的H₂O₂对PC-12细胞活性的影响显著,且24 h时没有对细胞造成过量损伤凋亡。所以选择200μmol/L的H₂O₂构建氧化应激细胞模型。氧化应激模型细胞的CAT、SOD水平随时间的增长逐步降低,ROS荧光强度显著增高,说明氧化损伤的程度增加。q PCR检测了lncRNA NONRATT017220.2（命名为lncRNA-TBIAT）等lncRNA在细胞模型组表达升高,与测序结果一致。lncRNA-TBIAT靶基因为Pim-1,根据GO和KEGG功能富集的结果,lncRNA-TBIAT与JAK-STAT通路有关,因而我们预测lncRNA-TBIAT可能与TBI后的氧化应激有关。根据Targetscan数据库和miRTar Base数据库预测结果,miR-124-3p可能是lncRNA-TBIAT及Pim-1调控的miRNA。（三）lncRNA-TBIAT通过miR-124-3p/Pim-1调控神经细胞氧化应激及凋亡敲低lncRNA-TBIAT后,siRNA-LncRNA-TBIAT组的lncRNA-TBIAT的表达水平显著降低,细胞活性显著降低,细胞凋亡率显著增加,ROS水平显著提高,CAT和SOD的活性均减弱。双荧光素酶报告和AGO2实验证实lncRNA-TBIAT可以吸附miR-124-3p。敲低lncRNA-TBIAT后,miR-124-3p inhibitor组细胞活性提高,细胞凋亡率下降,氧化应激水平下降;而miR-124-3pmimic组的细胞活性降低,细胞凋亡率增加,氧化应激水平增加。过表达miR-124-3p后miR-124-3p表达水平显著增加,基因Pim-1表达水平显著降低。利用双荧光实验,验证miR-124-3p与基因Pim-11的靶向结合。Western blot实验验证了过表达miR-124-3p抑制了PC-12细胞中的Pim-1蛋白的表达水平。研究结论TBI后脑皮层组织有明显的ln RNAs,mRNAs和miRNAs表达谱改变。本研究筛选并确定了目的基因lncRNA-TBIAT,发现其对神经细胞的氧化应激损伤可能具有保护性作用,抑制lncRNA-TBIAT会引起氧化应激细胞模型细胞活性降低、氧化应激加重,细胞凋亡率增加。LncRNA-TBIAT是通过吸附miR-124-3p调节Pim-1的表达在氧化应激和细胞凋亡中发挥调控作用的。