猪伪狂犬病是一种主要引起公猪不育、母猪流产死胎、新生仔猪大量死亡、育肥猪生长停滞的一种危害全球养猪业的重大传染病之一。近些年来,伪狂犬病在我国呈爆发流行趋势,给我国养猪业带来巨大损失。gE基因是伪狂犬病毒11个囊膜糖蛋白中一个十分重要的毒力蛋白基因。当前市场上PRV大部分的弱毒疫苗和灭活疫苗均有缺失gE基因,但因为伪狂犬具有潜伏感染性,单纯使用疫苗并不能根除PRV。因此,结合相应的区分野毒感染猪和疫苗免疫猪的鉴别诊断方法,坚决淘汰PRV野毒感染猪是根除伪狂犬的根本措施。目前,我国的PRV野毒鉴别诊断主要依赖于进口国外昂贵的试剂盒,开发出能准确鉴别PRV野毒的国产诊断试剂盒十分必要。本研究通过将PRV gE基因克隆至pFastBac/HBM-TOPO载体,转化含有杆状病毒穿梭质粒的DH10BacTM E.coli,通过三重抗性和蓝白斑筛选,得到含有PRV gE基因的重组Bacmid,将其转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。分别用间接免疫荧光(IFA)、SDS-PAGE和Western blot方法,对重组杆状病毒表达的蛋白进行鉴定和分析,结果表明:g E蛋白在Sf9细胞中得到高效表达,并且具有良好反应原性。使用经过蔗糖梯度密度离心纯化的PRV病毒免疫6-8周龄BALB/c小鼠,4次免疫后取小鼠脾细胞进行细胞融合,以表达gE蛋白作为抗原建立的间接ELISA方法筛选阳性细胞克隆,经过三次亚克隆获得了3株稳定分泌gE单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1H1、7D4、5F2。通过相对亲和力测定和IFA效价检测,结果1H1单抗和gE蛋白的相对亲和力最强,IFA的效价最高,达1:1600。对1H1单抗的生物学特性鉴定表明:其染色体数目正常,抗体亚类其重链为IgG1,轻链为κ。IFA特异性鉴定表明其具有良好的特异性。采用改良过碘酸钠法将1H1 gE单抗进行HRP酶标记,以gE蛋白作为包被抗原,建立了PRV gE阻断ELISA方法。对常见的猪病毒病CSFV、PPV、PRRSV、JEV的标准阳性血清进行检测,结果检测均为阴性,表明本方法具有良好的特异性。和IDEXX PRV gpI抗体检测试剂盒的敏感性对比试验显示:本方法具有较好的敏感性。对238份临床血清样品的检测结果表明:本方法与国外IDEXX PRV gpI抗体检测试剂盒总体符合率达到了90.34%。综上,本方法可用于PRV野毒感染和疫苗毒免疫的鉴别诊断,为我国准确鉴别伪狂犬野毒的gE-ELISA诊断试剂盒的研制奠定了基础。