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目的:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是临床上的常见慢性病与多发病,多见于老年人,主要表现为关节囊增厚、骨组织异常增生、软骨的磨损破坏,常导致关节疼痛、关节破坏、功能丧失。由于OA的病因病机目前尚未完全明确,因此缺乏安全有效的治疗方法,目前临床上治疗OA的方法主要以缓解疼痛为主,减轻体重、减少活动量、注意饮食等辅助缓解关节的疼痛。为了找到更好治疗OA的办法,有研究者提出,通过细胞移植修复软骨损伤的方法得到广大认可,由于软骨组织是由软骨细胞与Ⅱ、Ⅸ、Ⅺ型胶原蛋白和蛋白聚糖共同组成,自体软骨细胞移植存在局限性,并且体外软骨细胞存在来源少、增殖能力弱、存活时间有限等不足,传统的软骨移植术并不理想。骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells,BMSCs）是存在于骨髓内的一类干细胞,在适当的条件下可分化为骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞等,参与人体组织的修复和再生,因此,以BMSCs源性软骨细胞为种子细胞修复OA受损的软骨是一种理想的方法。已经发现细胞因子能促BMSCs成软骨细胞分化,但因其价格昂贵、成本较高、半衰期短、生物安全性等因素无法正常运用到临床工作中。因此,寻找安全、有效诱导BMSCs成软骨细胞分化的方法是解决问题的关键。中医认为,OA属于“骨痹”,其本在“肾”,补肾中药能够通过滋补肝肾治疗OA,本项目组前期研究表明某些补肾中药单体酚类能促进BMSCs成软骨细胞分化。补肾中药桑葚,药食两用,滋补肝肾。桑橙素（Maclurin）是桑葚的有效活性成分,含有酚类具有强氧化性,并且发现Maclurin能够促进BMSCs成软骨细胞分化,但是,关于Maclurin促进BMSCs成软骨细胞分化的机制还不清楚。小分子RNA（microRNA,miRNA）是一类存在于真核生物体内相当保守的内源性非编码单链RNA,它能通过调节其靶mRNA的表达而影响蛋白的表达,在细胞形成发育的成熟过程中起着重要作用。miRNA也是软骨形成的一类重要调节因子,本研究旨在探究中药小分子Maclurin能否促进BMSCs成软骨细胞分化,是否是通过影响miRNA-靶基因的机制调控BMSCs成软骨细胞分化。方法:1、全骨髓培养法获取SD大鼠的BMSCs,掌握BMSCs培养、传代、冻存、复苏等方法,在倒置光学显微镜下观察细胞生长状况,生长状态良好的细胞用于后续实验。2、查阅文献,选取体外诱导BMSCs成软骨细胞分化的最佳方案,实验分为Blank组和Induce组,诱导剂作用生长状态良好的BMSCs 7 d,通过免疫荧光观察与早期成软骨细胞分化相关蛋白Sox9、Coll2a的荧光强弱,通过Western Blot检测Sox9、Coll2a蛋白的表达水平。3、Cell Counting Kit-8（CCK 8）法检测Maclurin作用于BMSCs的细胞毒性,实验分为Blank组、DMSO组、Induce组、Maclurin组。作用7d之后,采用免疫荧光实验观察与早期成软骨细胞分化相关蛋白Sox9、Coll2a的表达,通过Western Blot实验检测Sox9、Coll2a蛋白的表达水平。4、RNA提取试剂提取Blank组、Induce组、Maclurin组的总RNA,通过RT-qPCR实验检测miR-203a-3p的表达情况。5、脂质体转染miR-203a-3p的mimic、m-NC、inhibitor、i-NC至BMSCs,诱导7d,采用免疫荧光实验观察与早期成软骨细胞分化相关蛋白Sox9、Coll2a的荧光强弱,通过Western Blot实验检测Sox9、Coll2a蛋白的表达水平。6、生物信息学网站预测miR-203a-3p的靶基因,通过免疫荧光、Western Blot实验检测靶蛋白的表达情况,最后通过构建双荧光素酶报告基因验证miR-203a-3p与靶基因的关系。7、构建靶基因的三个干扰片段,用Western Blot实验筛选最佳干扰片段,将筛选出的干扰片段转染至BMSCs诱导7 d,用Western Blot实验检测与早期成软骨细胞分化蛋白Sox9、Coll2a的表达水平。结果:1、全骨髓培养法获取的BMSCs,通过流式细胞术检测P3代细胞为纯度较高的BMSCs,可以用于后续实验。2、采用TGF-β3体外诱导BMSCs成软骨细胞分化,通过免疫荧光、Western Blot检测发现,Induce组中Sox9、Coll2a蛋白的表达显著（P<0.05）。3、CCK 8实验结果表明,25μg/mL的Maclurin对BMSCs没有细胞毒性（P>0.05）。免疫荧光和Western Blot实验结果表明,25μg/mL的Maclurin对TGF-β3诱导BMSCs成软骨细胞分化有增效作用（P<0.05）。4、RT-qPCR的结果表明miR-203a-3p在Maclurin促进BMSCs成软骨细胞分化过程中表达量显著下降（P<0.05）。5、miR-203a-3p 的 mimic、m-NC、inhibitor、i-NC 转染至 BMSCSs,TGF-β3 诱导培养基诱导培养7d后,免疫荧光结果表明,mimic组中Sox9、Coll2a蛋白的荧光强度要弱于Induce组,而inhibitor组中Sox9、Coll2a蛋白荧光强度强于Induce组。通过Western Blot实验结果也证明了mimic组中Sox9、Coll2a蛋白表达低于Induce组（P<0.05）,而 inhibitor 组中 Sox9、Coll2a 蛋白表达高于 Induce 组（P<0.01）。6、生物信息学网站预测Smad1是miR-203a-3p的靶基因,通过免疫荧光结果表明mimic组中Smad1蛋白的荧光强度弱于m-NC组。而inhibitor组中Smad1蛋白的荧光强度高于i-NC组。Western Blot实验表明了 mimic组中Smad1蛋白表达低于m-NC组。而inhibitor组中Smad1蛋白表达高于i-NC组。双荧光素酶报告基因结果表明野生型质粒中miR-203a-3p mimic组荧光强度弱于m-NC组、inhibitor组则高于i-NC组（P<0.05）,但是突变型质粒中四个组荧光强度变化无差异（P>0.05）。7、Western Blot实验结果表明siR-Smad1-002、siR-Smad1-003均有沉默效果,其中siR-Smad1-003的沉默效果最为显著（P<0.01）。将siR-Smad1-003片段转染至BMSCs,Western Blot实验结果表明Smad1的表达下降会影响早期成软骨细胞分化蛋白Sox9、Coll2a 表达下降（P<0.05）。结论:Maclurin调控miR-203a-3p/Smad1促BMSCs成软骨细胞分化。