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水稻(Oryzasativa)为一年生禾本科植物是重要的经济作物之一,也是杂种优势现象在农业生产中运用最成功的作物之一。杂交水稻显著提高了水稻的单产,在一定程度上解决了粮食危机问题,但是杂交种的后代会出现性状分离,无法保持杂种优势,每年的育种工作耗费人力、物力和财力,至今杂种优势的机理尚未明确。本实验通过比较水稻纯系亲本日本晴(Nipponbare)、93-11和其正反交杂交种愈伤组织之间miRNAs表达差异,寻找参与调控水稻杂交种F1代愈伤组织分化能力超亲现象的相关miRNAs;并通过对水稻纯系亲本和杂交种愈伤组织的组织解剖学分析;从组织学和分子水平上解释水稻中miRNAs对杂交种愈伤组织分化能力超亲这一杂种优势现象的调控机制,开展了如下研究:(1)水稻愈伤组织组织学观察。利用水稻纯系亲本粳稻Nipponbare(japonica)、籼稻93-11(indica)以及其正反交杂交种N9(Nip为母本,93-11为父本)、9N(93-11为母本,Nip为父本)的成熟胚作为外植体,诱导愈伤组织并分化,并统计诱导率和分化效率;利用石蜡切片技术,观察不同基因型愈伤组织的细胞特征。结果表明,水稻正反交杂交种愈伤组织细胞排列规律,内部分布着大量薄壁细胞,外侧分布大量具备较强分生能力的细胞团,为杂交种高效率的分化奠定了基础;而纯系亲本,尤其93-11愈伤组织的细胞分布无规则,且严重缺乏具有分生能力的细胞团,大部分细胞壁出现木质化或木栓化,这可能成为制约其分化的重要因素。(2)水稻杂交种愈伤组织分化能力超亲相关miRNAs的筛选鉴定。利用Illumina solexa高通量测序技术,筛选杂交种与模拟杂交种中差异表达miRNAs,并对其潜在靶基因进行功能分析,进一步综合分析筛选到少量候选miRNAs,作为后续验证分析的对象。结果证实,在组织培养条件下,杂交种与纯系亲本之间的miRNAs表达呈现明显差异,涉及大量细胞再生和繁殖的相关代谢通路。(3)候选miRNAs的功能验证及分析。利用STTM技术构建候选miRNAs的沉默载体,经过农杆菌转化获得水稻转基因植株。对转基因植株成熟胚诱导的愈伤组织分析发现,转基因愈伤组织分化能力显著下降,对其愈伤组织解剖学分析发现,Osa-miR396的沉默导致水稻愈伤组织显微结构和形态发生变化,进一步证实Osa-miR396参与水稻杂交种愈伤组织分化能力超亲现象的调控。与此同时,将沉默植株STTM-Osa-miR396作为母本与父本93-11杂交,获得杂交种STTM-Osa-miR396/9311,对miR396和其靶基因的表达量进行分析,并进行组织学观察,发现与沉默植株杂交后获得的杂交种分化能力与杂交种N9相比大大下降。