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烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etch virus protease,TEVp)因作用序列的专一性强广泛用于切除融合标签,虽然我们之前研究的突变体TEVp5M同义突变体在大肠杆菌表达的蛋白产量有较大提高,但蛋白酶的活性有所下降。为进一步改善TEVp蛋白折叠并提高其表达水平,我们结合不同方法获得高产量及活性都改善的新型TEV蛋白,通过构建融合蛋白形式,可以在相应亲和介质酶切不同融合蛋白,获得以下结果:1.构建了3个突变体。以TEVp5M同义突变体为模板,构建3个突变体K45F、E106G和K45F/E106G。2.分析TEVp突变体表达水平和活性。SDS-PAGE和蛋白印迹定性检测和GFP荧光值定量检测表明E106G突变体在大肠杆菌BL21(DE3)的水溶性表达水平比对照高28%,而其它两个突变体K45F和K45/E105G低于对照。定性和定量分析TEVp酶切纯化蛋白底物GST-tevS-eDAL表明,E106G突变体的切割效率比对照高32%,其它两个突变体的活性低于对照。3.构建了5个TEVpE105G融合蛋白。其N端分别含有标签MBP、GroEL、GroES或DnaK,蛋白标签和目的蛋白用TEVp识别序列连接,InfB(1–21)序列直接和TEVp突变体连接。4.分析了融合蛋白中TEVp突变体表达水平和活性。在BL21(DE3)中,DnaK和MBP对改善TEVp突变体水溶性效果最好,而InfB(1–21)序列对促进蛋白水溶性表达效应低于组氨酸标签,而GroEL和MBP显著提高了TEVp突变体活性。5.分析提高胞内稀有tRNA水平对标签效应的影响。在RosettaTM(DE3)中,InfB(1–21)序列和MBP提高TEVp突变体水溶性效果最好。而InfB(1–21)序列和GroEL提高了蛋白酶活性效率最高。6.分析融合蛋白中TEVp识别序列的作用。构建了除去TEVp识别序列的MBP与TEVp的融合蛋白,发现该序列对融合蛋白的可溶性表达没有显著影响,但可以提高突变体在大肠杆菌RosettaTM(DE3)中的酶活性。7.分别纯化了带不同标签突变体蛋白,分析了产量和活性,确定了不同亲和介质上酶切5个融合蛋白的效率。综上所述,本研究证明进一步的氨基酸突变对改善蛋白酶水溶性受其它已突变位点的影响,一些融合蛋白标签对改善TEVp突变体的产量和质量受内源稀有tRNA丰度影响,在RosettaTM(DE3)中,我们首次证明GroES能提高TEVp蛋白突变体的水溶性;现有研究表明不同菌株中明晰标签效应很重要,即使有蛋白标签的作用,纯化的TEVp不同时具备最优化的产量和质量。构建的TEVp突变体融合蛋白用于柱上酶切,可以一步分离出纯度较高的靶蛋白。