【摘 要】
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半胱氨酸是构成蛋白质的20种天然氨基酸之一,其侧链巯基易受活性氧物种刺激从而发生氧化修饰,并参与生物体内的氧化还原调控,与许多生理病理过程息息相关。因其侧链巯基独特的亲核性,半胱氨酸的生物偶联反应一直是蛋白质修饰所关注的热点问题之一。然而,现有的半胱氨酸的生物偶联反应大都存在着选择性不佳、反应效率低下等一些不足之处。本工作依据软硬酸碱理论,并利用吡啶与巯基之间特别的氢键作用,对半胱氨酸标记试剂进行
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半胱氨酸是构成蛋白质的20种天然氨基酸之一,其侧链巯基易受活性氧物种刺激从而发生氧化修饰,并参与生物体内的氧化还原调控,与许多生理病理过程息息相关。因其侧链巯基独特的亲核性,半胱氨酸的生物偶联反应一直是蛋白质修饰所关注的热点问题之一。然而,现有的半胱氨酸的生物偶联反应大都存在着选择性不佳、反应效率低下等一些不足之处。本工作依据软硬酸碱理论,并利用吡啶与巯基之间特别的氢键作用,对半胱氨酸标记试剂进行设计优化,合成了2-吡啶炔酮类系列化合物,在不影响反应速率和产率的前提下提高了标记试剂对半胱氨酸的选择性。我们首先对模型反应进行了研究,发现2-吡啶炔酮衍生物与半胱氨酸底物反应高效快速。通过比较不同基团与巯基相互作用的差别,预测出了2-吡啶炔酮类化合物与半胱氨酸反应的过渡态结构;结合模型反应数据,对反应机理进行了探讨。随后,我们进一步将得到的标记试剂应用到蛋白质半胱氨酸残基的标记。利用蛋白质免疫印迹法及荧光蛋白成像等方法探讨了该类标记试剂对重组蛋白质半胱氨酸残基的标记效率。最终,我们使用2-吡啶炔酮类标记试剂对曲妥珠单抗进行标记,探索了其在抗体药物偶联中的潜在应用价值;我们也将该试剂成功应用于化学蛋白质组学的研究,对HeLa细胞裂解液的标记反应,在5分钟内捕获到4000多个半胱氨酸位点,相较于传统的碘代酰胺试剂更加快速高效。
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