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第一章HBcAg/HBeAg对人树突状细胞表型和功能的影响目的在已研究的HBsAg对体外培养的人自体树突状细胞治疗性疫苗表型和功能的影响基础上,研究HBcAg/HBeAg对体外培养的人自体树突状细胞治疗性疫苗表型和功能的影响。方法1、取20例健康志愿者外周静脉血,肝素抗凝,以密度梯度离心法分离淋巴细胞。以GM-CSF,IL-4刺激,常规培养获得DC。再分别加入TNF-α、HBcAg+TNF-α、HBeAg+TNF-α刺激后,依次分组为:mDC组、HBcAg+mDC组、HBeAg+mDC组。2、在培养第10天检测各组树突状细胞的表型以及分泌的细胞因子IFN-γ和IL-12p70的变化。3、mDC组、HBcAg+mDC组、HBeAg+mDC组树突状细胞诱导的自体悬浮淋巴细胞增殖效应:在培养第7天与自体悬浮淋巴细胞共培养5天,在培养结束前12h加入1μCi/孔3H甲基胸腺嘧啶,用液体闪烁计数仪检测树突状细胞诱导的自体悬浮淋巴细胞增殖效应(cpm值)。4、mDC组、HBcAg+mDC组、HBeAg+mDC组树突状细胞体外诱导的淋巴细胞毒活性:以HepG2为靶细胞,在第13天以乳酸脱氢酶法,按CytoTox 96 Non-Radioactive Cytotoxicity Assay试剂盒说明书,检测树突状细胞体外诱导的淋巴细胞毒活性。结果1、分别加入TNF-α、HBcAg+TNF-α、HBeAg+TNF-α刺激后,在光镜下各组均可见大量具有树突样突起的悬浮细胞,成簇分布。观察发现HBcAg+mDC组的树突状细胞聚集最早最明显,凋亡较多,3天后细胞数量明显减少。2、观察各组中树突状细胞CD83、CD86、HLA-ABC的水平: HBcAg+mDC组和HBeAg+mDC组高于mDC组(P<0.01); HBcAg+mDC组高于HBeAg+mDC组(P<0.01)。3、HBcAg和HBeAg可显著增强mDC分泌IFN-γ、IL-12p70的量(P<0.01)。IL-12p70的分泌量HBcAg+mDC组低于HBeAg+mDC组。4、HBcAg+mDC、HBeAg+mDC、mDC组树突状细胞体外诱导的混合淋巴细胞增殖和杀伤效应均较显著,与HBcAg、HBeAg、自体悬浮淋巴细胞增殖和杀伤效应相比有显著性差异(P<0.01)。HBcAg+mDC、HBeAg+mDC两组与mDC诱导组之间的增殖和杀伤效应也具有显著性差异(P<0.01)。结论1、树突状细胞作为治疗性疫苗在体外培养,受TNF-α、HBcAg+TNF-α、HBeAg+TNF-α刺激后会有不同程度的分化、成熟或凋亡。2、随着树突状细胞的成熟,树突状细胞表达CD83、CD86、HLA-ABC的水平相应有不同程度的提高。3、随着树突状细胞的成熟,其分泌的细胞因子IFN-γ、IL-12p70的量相应有不同程度的增加。4、随着树突状细胞的成熟,其体外诱导的淋巴细胞增殖及杀伤功能均有不同程度的增强。第二章IL-10,TNF-α对慢性乙型肝炎患者树突状细胞的影响目的研究IL-10和TNF-α对慢性乙型肝炎患者树突状细胞的分化与功能的影响。方法1、健康志愿者和慢性乙型肝炎患者各15例,取外周静脉血,分离获得外周血单个核细胞(PBMC),常规培养获得DC组。2、培养期间用IL-10刺激的为imDC组;TNF-α刺激的为mDC组;先后用IL-10,TNF-α刺激的为imDC+TNF-α组。3、各组收获细胞后分别检测反映DC成熟度的各种分子及其体外诱导的自体淋巴细胞增殖效应。结果1、源于慢性乙型肝炎患者的常规培养的DC在数量,HLA-A, B, C、HLA-DR、CD86表达,IL-12p70分泌及其诱导的淋巴细胞增殖效应,均低于健康者组(P<0.01)。2、mDC组:源于慢性乙型肝炎患者的mDC与健康者mDC表达的HLA-DR、HLA-A, B, C、CD86比较无显著性差异;两组mDC诱导自体淋巴细胞增殖效应和分泌的IL-12p70均明显增加,比较有显著性差异(P<0.01)。3、imDC组:两组imDC的HLA-A, B, C、HLA-DR、CD86较mDC组低表达,分泌的IL-12p70极低,不能强烈激活诱导淋巴细胞增殖效应,与常规培养DC组比较有显著性差异(P<0.01)。4、imDC+ TNF-α组:加入TNF-α刺激后HLA-A, B, C、HLA-DR、CD86仍低表达,分泌的IL-12p70和淋巴细胞增殖效应仍较低。5、健康对照组、慢性乙型肝炎组的上清夜中IL-21的ELISA检测值均较低,无显著性差异。结论1、慢性乙型肝炎患者DC经TNF-α刺激后可同健康者一样高表达HLA-DR,HLA-A, B, C,CD86,但分泌IL-12p70仍较低,考虑为等量采集静脉血经相同方法培养后慢性乙型肝炎组在悬浮细胞数量上明显少于健康对照组所致。实验结果说明慢性乙型肝炎患者DC的状态虽然存在缺陷但在TNF-α的刺激下仍可向成熟分化。2、使用IL-10抑制DC的发育成熟结果表明慢性乙型肝炎患者DC的数量,表达HLA-DR、HLA-A, B, C、CD86,诱导的自体淋巴细胞增殖及分泌细胞因子与未用IL-10相比有一定差距。3、IL-10抑制的树突状细胞再加入TNF-α仍能保持不成熟的状态,其表面共刺激分子在接受TNF-α刺激后仍低表达,但是否能在致病微生物等致病抗原的刺激下仍能保持抑制状态还有待进一步研究。4、IL-10可有效抑制DC的成熟,在慢性乙型肝炎患者和健康者两组间无明显差异,说明慢性乙型肝炎患者的DC和健康者一样可进行调控,这是所有HBV感染者进行免疫治疗的基础。