急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是由多种病因导致的胰腺内胰酶被活化,进而引起胰腺组织的自身消化、水肿、出血甚至坏死的急性炎症反应性疾病。AP是急诊科常见的急腹症之一,具有起病急、进展快以及病情重等特点。我国每年约有40万人罹患AP,大部分为轻度AP(mild acute pancreatitis,MAP),呈自限性;其中,20%-30%的轻度AP患者病情加重,进展为重症AP(severe acute pancreatitis,SAP)。SAP严重时会引起全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)和多器官功能衰竭综合征(multiorgan dysfunction syndrome,MODS),进而导致患者死亡,病死率高达30%,严重危害我国人民群众的生命健康和生活质量。胰腺滤泡细胞被破坏是MAP进展为SAP的最重要原因之一。胰腺滤泡细胞约占胰腺细胞的80%-85%,是胰腺外分泌部最主要的细胞类型,可以分泌产生各种消化酶原颗粒,如胰蛋白酶原、胰糜蛋白酶原、胰淀粉酶、胰脂肪酶以及核糖核酸酶。胰腺滤泡细胞中的胰酶一旦被活化,即可出现局部炎症反应,进而引起炎症细胞、活性氧(reactive oxygen species,ROS)与血管活性物质蓄积,最终诱发胰腺局部炎症的级联扩大,致使胰腺炎由轻转重,直接影响患者的生存及预后。但时至今日,AP引起胰腺滤泡细胞损伤的具体机制仍不清楚。因此,探究AP致胰腺滤泡细胞损伤的具体作用机制,进而寻求更为有效的治疗靶标,是目前亟待解决的重要科学问题。ROS大量产生是AP早期的主要病理改变之一,在AP病情进展过程中发挥着重要作用。胰腺是富含脂质的消化腺,ROS的大量产生会引起胰腺组织脂质过氧化,进而可能导致脂质过氧化终末代谢产物毒性醛类的生成增加。然而,胰腺组织脂质过氧化及其产生的毒性醛类在AP中的作用鲜有研究探讨。乙醛脱氢酶2(aldehyde dehydrogenase 2,ALDH2)是多种毒性醛的代谢酶,例如乙醛、4-羟基壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)和丙二醛(malondialdehy de,MDA)等,可将它们氧化代谢为低毒性的羧酸类物质。有研究表明,上调心力衰竭大鼠心肌ALDH2表达,可以抑制心肌细胞凋亡、降低毒性醛水平,改善左心室收缩功能。过表达ALDH2可以通过影响ASK-1、GSK-3β信号通路显著改善酒精性心肌病、糖尿病心肌病的进展。另外还有研究显示,激活或过表达ALDH2,可以改善扩张性心肌病以及肺动脉高压的严重程度。上述研究表明ALDH2通过代谢毒性醛类物质在许多疾病的发生发展中发挥保护作用。基于脂质过氧化在AP中重要的病理作用,ALDH2作为代谢毒性醛类的关键酶是否参与调控AP胰腺损伤发生发展过程是亟待揭示的科学问题,这将有助于AP新治疗靶点的发现。因此,在本研究中我们将深入研究AP胰腺组织中毒性醛蓄积情况以及ALDH2对胰腺滤泡细胞损伤的保护作用及机制。研究目的1.明确AP时胰腺组织中毒性醛的蓄积情况。2.探讨毒性醛在AP中的作用及分子机制。3.明确提高ALDH2活性对胰腺滤泡细胞损伤的保护作用及机制。研究方法(一)体内(动物)实验方案1.雨蛙素诱导的AP模型构建:选择10周龄左右雄性小鼠,连续7次腹腔注射雨蛙素50μg/kg,1 h/次;对照组给予等剂量无菌生理盐水(normal saline,NS)。最后一次腹腔注射24 h后麻醉并处死小鼠,用于后续相关指标的检测。2.实验小鼠分组:小鼠随机分为4组,每组10只:Alda-1对照组(Alda-1)与Alda-1模型组(Alda-1+AP),诱导AP模型前1 h腹腔注射DMSO溶解的Alda-1(20mg/kg);对照组(Con)与AP组,腹腔注射同等体积的DMSO。选择10周龄左右雄性C57BL/6J小鼠(野生型,wild type,WT)小鼠和ALDH2基因过表达小鼠(transgenicmice,TG)小鼠,随机分为4组,每组10只:对照组(WT),ALDH2过表达小鼠组(TG),ALDH2野生型小鼠AP组(WT+AP),ALDH2基因过表达小鼠AP组(TG+AP),诱导AP模型。3.组织病理学评分:将小鼠胰腺组织进行HE染色,分析胰腺小叶间隙、腺泡水肿、片状坏死、实质及间质内炎性细胞浸润水平,同时评估红细胞在胰腺组织中的分布情况。4.胰腺滤泡细胞凋亡检测:分别使用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法、透射电镜观察以及蛋白印迹法(Western Blot)从细胞水平、亚细胞水平以及分子水平,检测胰腺滤泡细胞凋亡情况。5.毒性醛水平检测:使用免疫组织化学法和Western Blot检测各组胰腺组织中4-HNE与MDA的蓄积水平。分别使用酶联免疫吸附测定(enzyme linked im-munosorbent assay,ELISA)法和比色法检测人体血浆中4-HNE和MDA含量。6.胰腺组织ALDH2表达与活性检测:使用RT-qPCR法检测各组胰腺组织中ALDH2的mRNA水平,使用Western Blot检测各组胰腺组织中ALDH2蛋白表达水平。将分离提纯的线粒体裂解提取蛋白后与ALDH2底物反应,通过检测ALDH2代谢NAD+生成NADH的量反映各组胰腺线粒体中ALDH2的酶活性。(二)体外(细胞学)实验方案1.雨蛙素诱导胰腺滤泡细胞损伤模型及醛毒性模型建立:给予胰腺滤泡细胞细胞雨蛙素(10nM,NS溶解)处理24h,建立AP模型,对照组使用同等体积NS处理。给予胰腺滤泡细胞细胞4-HNE(DMSO溶解)处理12 h,建立醛毒性模型。雨蛙素或4-HNE处理前给予胰腺滤泡细胞Alda-1(20μM,DMSO溶解)预处理30 min,Con组给予相同体积DMSO。处理结束后进行相关指标检测。2.胰腺滤泡细胞凋亡情况评价:使用TUNEL法和Annexin V-FITC/PI法评价各组细胞凋亡比例。采用Western Blot的方法对各组细胞线粒体凋亡信号通路指标的蛋白表达情况评估。3.线粒体膜电位检测:采用JC-1法检测胰腺滤泡细胞在AP模型中的线粒体膜电位。4.构建ALDH2过表达/敲除细胞系:胰腺滤泡细胞感染ALDH2过表达慢病毒,经嘌呤霉素筛选后验证ALDH2蛋白表达效率,确认成功构建过表达ALDH2的胰腺滤泡细胞。利用CRISPR-Cas9技术,构建ALDH2基因敲除病毒载体,验证敲除效率后进行嘌呤霉素筛选,并挑选单克隆后进行测序验证和Western Blot验证。5.AKT磷酸化水平检测及激活:通过Western Blot法对各种胰腺组织或滤泡细胞中磷酸化AKT和总AKT水平检测并计算,评估AKT磷酸化情况。使用AKT磷酸化激活剂(SC79),上调胰腺滤泡细胞中AKT磷酸化程度。6.生物信息学分析及验证策略:将公开发表的数据库GSE109227和GSE119844中2个胰腺炎组织转录组结果进行联合分析,筛选出胰腺炎中有明显差异表达的基因,进行功能富集分析,并采用Western Blot对相关差异表达基因进行验证。研究结果1.AP过程中存在毒性醛4-HNE和MDA蓄积AP小鼠血清中MDA含量明显升高,并且与AP严重程度呈正相关。Western Blot和免疫组织化学染色结果发现,与Con组相比,AP组胰腺组织中4-HNE和MDA明显蓄积;与健康志愿者相比,AP患者血浆中4-HNE和MDA含量明显升高。2.胰腺组织中蓄积的毒性醛引起胰腺滤泡细胞凋亡生物信息学分析发现胰腺组织中促凋亡基因Bax表达升高,并通过Western Blot进行验证。TUNEL染色发现,AP胰腺组织以及AP细胞模型中胰腺滤泡细胞凋亡的比例升高,使用4-HNE体外刺激胰腺滤泡细胞发现,与Con组相比,AP组同样存在凋亡比例升高的情况。3.AP过程中胰腺组织ALDH2活性降低首先检测ALDH2的mRNA和蛋白表达发现,与Con组相比,AP组胰腺组织中ALDH2的mRNA水平和蛋白表达量未见明显变化,而ALDH2酶活性明显降低。4.ALDH2基因过表达减少AP导致的胰腺组织中毒性醛蓄积和胰腺滤泡细胞凋亡与WT组相比,WT+AP组胰腺组织中4-HNE和MDA有明显蓄积的情况,与WT+AP组相比,TG+AP组中的4-HNE和MDA蓄积情况明显减轻。通过对胰腺组织TUNEL染色发现,与AP组相比,Alda-1+AP组中胰腺细胞凋亡显著减轻,并且与线粒体凋亡指标的变化趋势相符合。5.过表达ALDH2减少AP导致的胰腺滤泡细胞凋亡与Con组或空载体病毒(NC)组相比,感染过表达ALDH2慢病毒(ALDH2-OE)组的胰腺滤泡细胞中,ALDH2表达明显升高;与对照组胰腺滤泡细胞相比,ALDH2-KO的胰腺滤泡细胞中ALDH2蛋白表达明显减少。通过构建AP细胞模型发现,与AP组相比,ALDH2基因过表达可以减轻胰腺滤泡细胞凋亡比例,ALDH2基因敲除会明显增加胰腺滤泡细胞凋亡比例。6.提高ALDH2活性可改善胰腺组织损伤,减少AP中毒性醛蓄积、胰腺滤泡细胞凋亡与AP组相比,Alda-1+AP组的胰腺重量、胰腺/体重明显降低;血清中胰淀粉酶、胰脂肪酶含量明显减少;HE染色结果显示:胰腺小叶间隙增宽,腺泡水肿,片状坏死,实质及间质内炎症细胞浸润程度明显减轻,红细胞分布数量减少。与AP组相比,Alda-1+AP组中胰腺组织中MDA和4-HNE的蓄积均显著减少。通过对胰腺组织TUNEL染色发现,与AP组相比,Alda-1+AP组中胰腺细胞凋亡显著减轻,并且观察到与线粒体凋亡指标的变化趋势相符合。7.提高ALDH2活性可以通过逆转毒性醛对AKT磷酸化的抑制作用,减轻胰腺滤泡细胞凋亡程度Western Blot检测结果发现,在雨蛙素诱导的AP细胞模型中,与Con组对比,AP组中AKT磷酸化程度明显减少;与AP组对比,Alda-1+AP组中AKT磷酸化程度明显提升。同样使用4-HNE刺激胰腺滤泡细胞后,与Con组对比,AP组中AKT磷酸化程度明显减少并且Bax、Cleaved Caspase 3表达量增多,Bcl-2表达量减少;与4-HNE组对比,Alda-1+4-HNE组中AKT磷酸化程度明显提升。为了明确AKT磷酸化程度与4-HNE的关系,使用AKT磷酸化激活剂(SC79)联合4-HNE刺激胰腺滤泡细胞,发现与4-HNE组相比,SC79+4-HNE组中Bax、Cleaved Caspase 3表达量减少,Bcl-2表达量增多。研究结论1.AP过程中存在毒性醛4-HNE和MDA的蓄积。2.AP过程中毒性醛蓄积抑制AKT磷酸化,导致胰腺滤泡细胞凋亡增加,从而加重AP的严重程度。3.提高ALDH2活性可以逆转雨蛙素或4-HNE对AKT磷酸化的抑制作用,减少胰腺滤泡细胞凋亡。