【摘 要】
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目的:肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒心肺综合征（HCPS）是由致病性汉坦病毒引起的两大流行性人畜共患病,其中汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）是引起我国HFRS的主要病原体之一。外泌体是细胞之间信息交流的新载体,发挥作用主要依赖于其包裹的内容物。多项研究表明病毒感染细胞释放的外泌体可以阻断或促进受体细胞中的病毒感染,但人们对外泌体在汉坦病毒感染中的作用了解甚少。本课题旨在探究汉
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目的:肾综合征出血热（HFRS）和汉坦病毒心肺综合征（HCPS）是由致病性汉坦病毒引起的两大流行性人畜共患病,其中汉滩病毒（Hantaan virus,HTNV）是引起我国HFRS的主要病原体之一。外泌体是细胞之间信息交流的新载体,发挥作用主要依赖于其包裹的内容物。多项研究表明病毒感染细胞释放的外泌体可以阻断或促进受体细胞中的病毒感染,但人们对外泌体在汉坦病毒感染中的作用了解甚少。本课题旨在探究汉滩病毒感染宿主细胞旁分泌的外泌体如何通过远距离赋予受体细胞抗病毒能力以及刺激相应的免疫应答反应,对受体细胞发挥远程调控作用。方法:首先我们利用电镜、蛋白印迹以及NTA粒径分析方法对差速超速离心分离的HTNV感染血管内皮细胞上清中的外泌体（Exo-HV）进行多方面鉴定。利用实时定量PCR、蛋白印迹以及间接免疫荧光方法检测Exo-HV在未感染受体细胞中的抗病毒效果。然后通过高通量测序检测外泌体中独特表达的miRNA转录组并利用脂质体转染、实时定量PCR技术筛选出抗病毒效果最明显的miRNA。采用CRISPR/Cas9技术敲低miR-145-5p并应用Transwell模型验证HTNV感染诱导外泌体是否能介导的miR-145-5p传导入内皮细胞。运用双荧光报告系统检测miR-145-5p与HTNV 76-118 M片段是否存在直接靶向关系。最后利用ELISA、实时定量PCR以及蛋白印迹技术检测干扰素和干扰素刺激因子的表达变化。结果:电镜观察到HTNV感染HUVEC细胞所分泌的外泌体（Exo-HV）具有典型的外泌体杯状结构,蛋白印迹方法鉴定出外泌体的标志蛋白CD81、TSG101,NTA粒径分析检测外泌体直径在100 nm左右。Exo-HV可以显著减少细胞中病毒核酸S基因的合成,蛋白结果表明Exo-HV可以减少病毒蛋白NP以及GP的产生,间接免疫荧光实验表明Exo-HV处理组细胞内的绿色荧光（标记病毒蛋白NP）显著减少。外泌体转录组学miRNA芯片分析表明Exo-HV中有304个显着差异表达的miRNA,其中Exo-HV中有240个micro RNA上调,有64个micro RNA下调,比例为接近4:1。我们选择了其中上调最明显的20个miRNA过表达于HUVECs并感染HTNV,实时定量PCR发现miR-145-5p的过表达能够显著减少HTNV S基因表达。Transwell模型验证了HTNV感染诱导外泌体介导的miR-145-5p可以传导入内皮细胞中。双荧光结果表明miR-145-5p直接靶向HTNV 76-118 M片段。我们还发现外泌体miR-145-5p通过上调IFN-β和ISG的表达抑制HTNV在受体细胞中的复制。结论:在我们的研究中,我们鉴定了源自HTNV感染的HUVECs的外泌体（Exo-HV）,并在未感染的受体细胞中发现了Exo-HV的抗病毒特性。高通量测序揭示了Exo-HV中独特表达的miRNA转录组,20个上调明显的miRNA筛选结果发现miR-145-5p是包装在Exo-HV中的抗病毒效果最明显的miRNA,能够转移到受体细胞并通过直接靶向HTNV 76-118的M片段,亦可通过诱导I型干扰素反应而起作用,从而抑制病毒复制。总之,这项研究表明HTNV感染的HUVECs释放的外泌体是实现细胞间交流的重要介质,而miR-145-5p作为其中发挥作用的重要分子,可以在邻近的未感染细胞中发挥新的抗病毒作用,这将有助于我们探索新的策略利用外泌体和miRNA治疗病毒感染性疾病。
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