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研究背景胶质母细胞瘤(Glioblastoma),是神经系统最常见的高度恶性胶质瘤,占神经外胚叶来源肿瘤的50-55%,占成人颅内肿瘤的25%。即使运用先进手段进行积极的手术,实施包括取得巨大进步的化疗和放疗,病人的预后仍然很差。因此需要探索新的治疗方式和药物。毛蕊花糖苷(Verbascoside)是肉苁蓉中的主要有效成分,分子具有亲水性并能透过血脑屏障。研究已证明其具有免疫调节,抗炎抗氧化等药理作用。近年来发现其对肝癌,结肠癌,胃癌等肿瘤具有治疗作用,但是其对胶质瘤的作用还未见报道。而且已有研究发现Verbascoside能增强激活的巨噬细胞的SHP-1的表达。而SHP-1/STAT3信号通路在胶质母细胞瘤的发生发展有重要作用,因此我们推测其在胶质母细胞瘤中能否同样对SHP-1有影响,进而对胶质母细胞瘤产生抑制作用。研究目的1.研究Verbascoside对胶质母细胞瘤的增殖、凋亡、迁徙侵袭等生物行为学影响。2.研究Verbascoside对SHP-1/STAT3信号通路的影响。3.研究Verbascoside能否增强替莫唑胺(Temozolomide)的抗胶质母细胞瘤作用。4.研究Verbascoside能否抑制裸鼠皮下成瘤模型中胶质母细胞瘤的生长。研究方法用不同浓度的Verbascoside(VB)处理胶质母细胞瘤,并在不同时间点,采用MTT法检测Verbascoside对细胞增殖的影响,再计算出抑制率。采用Annexin V-FITC/PI双染色各组细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡。采用Transwell检测细胞迁徙、侵袭。Western blotting检测SHP-1/STAT3信号通路蛋白表达。并转染SHP-1 siRNA观察能否逆转Verbascoside对胶质母细胞瘤的生物行为学影响和相关蛋白的表达。联合Verbascoside与Temozolomide,研究Verbascoside能否增强Temozolomide的抗胶质母细胞瘤的作用。将裸鼠进行U87细胞移植,然后分组用PBS和Verbascoside腹腔注射,观察Verbascoside能否在体内抑制胶质母细胞瘤细胞生长。统计学分析所有数据使用均数士标准差(x± s)表示。使用SPSS 13.0统计学软件,对所测得的结果进行正态性和方差齐性的检验。两组间比较使用两样本t检验;多组间比较采用单因素方差分析,若方差齐性,多组间两两比较则用LSD检验,方差不齐选用Dunnett T3检验。检验水准为a =0.05,P<0.05认为有显著差异。研究结果1.Verbascoside引起Glioblastoma的增殖抑制和凋亡MTT法检测不同的浓度和时间的Verbascoside对细胞增殖的影响。发现Verbascoside能抑制胶质母细胞瘤的增殖。而且与药物浓度和时间具有交互作用。不同的浓度和时间的Verbascoside促进U87和U251发生凋亡。不同浓度的Verbascoside处理细胞后用Transwell检测,Verbascoside均能减弱细胞向下室迁徙侵袭的能力。Western Blot检测发现Verbascoside的作用机制是抑制胶质母细胞瘤的STAT3磷酸化,增加SHP-1的表达,并改变下游相关分子表达。Verbascoside对胶质母细胞瘤细胞生物行为学效应和蛋白改变能部分被SHP-1.siRNA逆转。2.Verbascoside增强Temozolomide对胶质母细胞瘤的增殖抑制和促凋亡作用MTT检测Temozolomide联合Verbascoside对胶质母细胞瘤的增殖抑制率高于单独应用Temozolomide组。联合组U87细胞的凋亡率高于Temozolomid单独用药组。在蛋白水平检测联合用药组能增加促凋亡蛋白表达,减少抗凋亡蛋白的表达。3.Verbascoside抑制裸鼠移植瘤的生长并影响相关蛋白表达PBS组和Verbascoside组的裸鼠体重无统计学差异。Verbascoside组肿瘤体积小于PBS组。Western Blot检测发现SHP-1/STAT3信号通路蛋白改变与体外实验一致。结论1.Verbascoside能通过上调SHP-1的表达而抑制STAT3的磷酸化,影响下游靶基因的表达,进而抑制胶质母细胞瘤的增殖、迁徙侵袭并促进其凋亡。2.Verbascoside能增强Temozolomide的抗胶质母细胞瘤作用。3.Verbascoside能抑制裸鼠皮下成瘤模型中胶质母细胞瘤的生长。