【摘 要】
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猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）引发断奶后多系统衰竭综合征（Post weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）、呼吸道疾病综合征（Pocine respiratory disease complex,PRDC）、猪皮炎肾病综合征（Porcine dermatitis and nephrotic syndr
【基金项目】
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绍兴市科技计划项目（2020B33002）; 浙江省“三农九方”农业科技协作计划揭榜挂帅项目（2022SNJF060）
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猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）引发断奶后多系统衰竭综合征（Post weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS）、呼吸道疾病综合征（Pocine respiratory disease complex,PRDC）、猪皮炎肾病综合征（Porcine dermatitis and nephrotic syndrome,PDNS）等多种疾病,给全球养猪业造成极大的经济损失。开发可快速检测PCV2抗体或抗原的诊断产品对于该病的防控具有重要的意义。基于此,本研究首先采用原核表达的方法获得重组PCV2 Cap蛋白,并通过免疫新西兰大白兔的方法制备多克隆抗体,在此基础上开发了PCV2 ELISA抗体检测试剂盒、乳胶免疫层析抗原检测试纸和磁珠化学发光抗原检测试剂盒,主要研究内容及结果如下:1、ELISA抗体检测试剂盒:以纯化的重组Cap蛋白为包被抗原,建立了定性分析的ELISA抗体检测方法。工艺参数的优化结果表明,最佳抗原包被浓度为4μg/m L;最佳封闭体系为2%的BSA;最佳封闭条件为4℃下16 h;最佳血清稀释度为100倍;最佳酶标抗体稀释度为1万倍;最佳血清孵育时间为30 min;最佳酶标抗体孵育时间为30 min;最佳TMB显色时间为10 min。性能验证的实验结果表明,在样本1600倍稀释情况下依旧具有良好的敏感性;仅在PCV2抗体阳性血清的检测中呈现阳性结果,其他病毒抗体阳性血清的检测结果均呈现阴性结果,与PCV1、PRRS、PRV、PPV、PEDV、CSF抗体阳性血清无交叉反应,具备良好的特异性;批内变异系数为1.4%,批间变异系数为2.46%,具备较高的精密度;临床样本的检出率为98%;在4℃环境下储存可保存12个月,具备良好稳定性。2、乳胶免疫层析抗原检测试纸:以抗Cap蛋白的多克隆抗体和乳胶微球制备免疫探针,用抗Cap蛋白的单克隆抗体和羊抗兔Ig G二抗分别包被T线和C线,建立定性分析的乳胶免疫层析抗原检测方法。工艺参数的优化结果表明,乳胶微球最佳直径为300 nm;最佳多克隆抗体结合量为80μg;最佳免疫探针喷涂量为1.5μL/cm;最佳T线点膜浓度和最佳C线点膜浓度均为1.0 mg/m L。性能验证的实验结果显示,该试纸的检出限为0.5 ng/m L,仅在PCV2抗原阳性血清的检测中呈现阳性结果,与其他猪病毒的抗原阳性血清样本无交叉反应,具备良好的灵敏度和特异性;临床样本的综合检出率为为93.33%;在常温环境下可保存12个月。3、磁珠化学发光抗原检测试剂盒:用多克隆抗体与磁珠微球结合后制备免疫探针,用吖啶酯标记单克隆抗体制备成为发光探针,建立定量分析磁珠化学发光抗原检测方法。工艺参数的优化结果表明,最佳单克隆抗体与吖啶酯的投料比为1:10;最佳多克隆抗体的结合量为68μg;最佳结合时间为120 min;最佳免疫探针封闭体系为2%的BSA;最佳免疫探针用量100μL;最佳样本稀释度为100倍;最佳二抗稀释度为4000倍;最佳样本孵育时间为25 min。性能验证的结果表明,该试剂盒在0.25 ng/m L至250 ng/m L的抗原浓度范围内具有良好线性;其检出限为51 pg/m L,定量限为68 pg/m L,具备较高的灵敏度;批间批内变异系数均小于5%,具备较高的精密度;临床样本的综合检出率为97.14%;在4℃环境下可保存至少12个月。本研究构建的三种试剂盒具备高灵敏度、高特异性、良好稳定性的特点,对猪圆环病毒2型的检测和预防具有重要意义。
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