背景:乙型肝炎是乙型肝炎病毒感染机体后导致的急性或慢性肝脏损伤。据统计,目前全世界乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染者超过3.5亿人,2015年全世界因乙型肝炎相关并发症如肝硬化、肝癌导致死亡人数达887,000人,不仅如此,HBV感染肝脏后引起的急性或慢性肝脏损伤均可导致肝功能不同程度下降,给患者身心健康带来严重影响。在中国,HBV慢性感染者占总人口比例超过8%,HBV所致肝脏疾病占据所有肝脏疾病的22.9%。因此,乙型肝炎在全世界尤其是中国仍是影响人类健康的主要问题,给社会带来了严重的负担。对于HBV感染的发病机制,目前普遍认为HBV感染机体后诱发的机体免疫反应在控制病毒复制中发挥了关键作用,但同时对肝脏也造成了难以避免的损伤。巨噬细胞是一种成熟的单核细胞,参与了机体的固有免疫和适应性免疫,它们通常在机体的固有免疫中扮演第一道防线的角色。一旦被激活,巨噬细胞一方面可以释放-系列促炎细胞因子参与到淋巴细胞极化及中性粒细胞趋化等一系列活动中,另一方面释放抗炎细胞因子参与炎症的调节。肝脏中的巨噬细胞,也叫库普弗细胞,是人体中最大的巨噬细胞群。库普弗细胞作为一群高效的吞噬细胞可以识别、吞噬及降解细胞残骸、外来物质及抗原。在HBV感染的情况下,库普弗细胞在有效促进抗病毒反应的同时也伴随一些不良的影响,目前已有大量结果表明巨噬细胞参与了 HBV相关的免疫介导的肝脏损伤过程。众所周知,HBV在感染肝细胞后不但可以在肝细胞中复制,而且可以编码HBsAg,HBeAg,HBcAg和HBX蛋白等一系列病毒相关蛋白。这些蛋白对机体免疫细胞尤其是巨噬细胞的影响和机制尚未明确。根据我们初步的研究结果,在诱导巨噬细胞活化过程中发挥关键作用的是HBeAg而不是HBsAg、HBcAg,HBeAg可以通过刺激巨噬细胞炎症因子的产生来加重肝脏损伤,进一步明确这其中的调控机制无论对于基础研究还是临床治疗均具有重要意义。MiRNAs是一类非编码小RNA分子,它们通过与其靶基因的3’非编码区(UTR)相互作用从而于转录后水平广泛影响基因的表达。大量研究表明miRNAs与肿瘤、神经系统疾病、炎症性疾病、心血管疾病及肝脏疾病等多种病理过程密切相关。近来发现许多miRNAs可以调控炎症反应过程,如miR-210通过作用于NF-κB1抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞的炎症反应,miR-93通过其靶点IRAK4抑制LPS诱导的小鼠巨噬细胞的炎症因子的产生。miR-212最早被广泛报道参与了神经系统疾病及肿瘤性疾病。新近有研究发现miR-212可以通过与免疫细胞、炎症因子等相互作用来影响癌症的发生、发展。在前列腺癌中,下调的miR-212-3p可以通过NF-κB通路来调节炎症因子的释放从而调控前列腺癌的进展。在胰腺癌中,miR-212-3p通过影响树突状细胞的功能来诱导胰腺癌肿瘤细胞的免疫耐受。由此可见,miR-212与免疫系统及炎症反应之间关系密切,但miR-212在不同炎症反应中发挥的具体作用尤其是在HBV感染过程中所扮演的角色及机制却鲜见报道。本研究利用多种细胞系以及正常人、乙肝患者作为研究对象,通过多种实验手段以及统计分析以期达到以下研究目标。研究目的:1.明确HBV相关抗原(包括HBcAg、HBeAg和HBsAg)在诱导巨噬细胞产生炎症因子中的作用。2.筛选出在HBeAg诱导的巨噬细胞活化中表达明显变化的miRNAs,分析筛选出来的miR-212-3p在HBeAg刺激的小鼠及人巨噬细胞系以及正常人外周血分离单核细胞中的表达情况。比较正常人与乙肝患者外周血单核细胞中miR-212-3p的表达差异。探究乙型肝炎患者外周血单核细胞中miR-212-3p表达水平与患者HBeAg水平等临床指标的相关性。3.研究miR-212-3p在HBeAg诱导的巨噬细胞激活中发挥的功能。探讨miR-212-3p在HBeAg诱导的巨噬细胞激活中的调控机制,包括调控miR-212-3p表达的分子机制,根据生物信息分析对miR-212-3p的潜在靶点进行预测,并对靶基因进行验证,以期以新的角度揭示乙肝病毒感染过程中巨噬细胞被激活以及肝损伤发生、发展的相关调控机制。所使用研究方法如下:研究方法:1.体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7,分别以一定浓度HBsAg、HBeAg、HbcAg以及其混合物刺激RAW264.7不同时间后光学显微镜下观察巨噬细胞的形态变化。通过qRT-PCR检测细胞中TNF-α、IL-6和IFN-β的表达水平,通过ELISA的方法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-6和IFN-β的分泌水平。提取小鼠腹腔原代巨噬细胞,分别以HBsAg、HBeAg、HbcAg以及其混合物刺激一定时间后光学显微镜下观察细胞的形态变化。通过qRT-PCR检测TNF-α、IL-6和IFN-β的表达水平,通过ELISA的方法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-6和IFN-β的分泌水平。2.以HBeAg刺激RAW264.7以不同的时间后,进行microRNA测序以筛选在HBeAg诱导RAW264.7活化过程中表达明显升高的microRNA。体外培养小鼠巨噬细胞系RAW264.7、人单核巨噬细胞系THP-1以及人白血病细胞系U937,采用细胞分离液分离人外周血单核细胞并进行培养。根据之前的测序结果,使用HBeAg刺激 RAW264.7 巨噬细胞 24h 后采用 qRT-PCR 检测 miR-155、miR-212-3p、miR-132、miR-21等的表达情况。通过HBeAg刺激THP-1、U937及人外周血单核细胞24h后,采用qRT-PCR检测上述细胞中HBeAg处理前后miR-212-3p的表达变化情况。qRT-PCR检测正常人以及慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞中miR-212-3p的表达差异。3.为了进一步探讨miR-212-3p在HBeAg刺激的巨噬细胞中的生物学作用,在 RAW264.7 巨噬细胞中分别转染了 miR-212-3p mimics、miR-212-3p inhibitor或者阴性对照物NC。转染48h后,采用HBeAg刺激RAW264.7巨噬细胞4h,采用qRT-PCR及ELISA分别检测细胞及上清液中IL-6和TNF-α的表达及分泌。4.为了解HBeAg刺激的巨噬细胞活化以及细胞因子表达及分泌的具体调控机制,通过HBeAg刺激巨噬细胞RAW264.7后,采用western blot方法测量磷酸化和非磷酸化形式MAPK的表达。接下来,分别以ERK、JNK、P38的抑制剂处理RAW264.71h后,再以 HBeAg 刺激 RAW264.74h 后,qRT-PCR 及 ELISA 分别检测细胞及细胞上清液中炎症因子IL-6和TNF-α的表达及分泌并与无抑制剂处理组进行比较。为了进一步探究MAPK和miR-212-3p之间的关系。我们分别以ERK、JNK、P38 的抑制剂(PD98059、SP600125、SB203580)预处理 RAW264.7 1h 后,再用HBeAg刺激RAW264.724h,qRT-PCR检测细胞中rmiR-212-3p的表达水平并与无抑制剂处理组进行比较。为了解CREB在巨噬细胞活化中的作用,以及MAPK与CREB之间的关系,一组采用HBeAg在不同时间点刺激巨噬细胞;另外一组分别以 ERK、JNK、P38 的抑制剂(PD98059、SP600125、SB203580)预处理RAW264.7 1h 后,再用 HBeAg 刺激 RAW264.7 30min,通过 western blot 检测磷酸化和非磷酸化CREB的表达。通过Jaspar软件预测得知CREB与miR-212-3p的启动子区域有多个结合位点。为了解CREB对miR-212-3p的调控作用,一方面,我们采用CREB抑制剂(KG-501)预处理RAW264.71h,然后以HBeAg刺激巨噬细胞24h后,qRT-PCR检测miR-212-3p的表达并与无抑制剂处理组进行比较。另一方面,我们将RAW264.7的核裂解物通过CREB抗体及非特异的IgG抗体进行免疫沉淀,然后通过标准终点PCR及琼脂糖凝胶电泳对抗体所结合的DNA序列进行分析。5.在 starBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)网站进行生物信息分析,利用 PITA,miRmap,PicTar,miRanda,TargetScan 等五个数据库软件对miR-212-3p的靶基因进行预测。通过westernblot、qRT-PCR及ELISA实验验证miR-212-3p的靶基因以及miR-212-3p通过靶基因对巨噬细胞功能的调控。研究结果:1.在HBV相关抗原中HBeAg在诱导巨噬细胞炎症因子释放的过程中发挥了主要作用。我们用不同的HBV相关抗原(HBcAg,HBeAg和HBsAg)以及其混合物刺激RAW264.7 12h或24h后,HBeAg或混合物刺激组的巨噬细胞形态发生了显著变化。与此同时,HBeAg或混合物刺激组细胞TNF-α,IL-6和IFN-β的表达和分泌在24、36及48h均有显著升高。在小鼠腹腔原代巨噬细胞中,HBeAg或混合物刺激组的腹腔原代巨噬细胞形态发生了显著变化。同样,HBeAg或混合物刺激组细胞TNF-α,IL-6和IFN-β的表达和分泌在36h均有显著升高。2.MiR-212-3p在HBeAg刺激的巨噬细胞和慢性乙型肝炎患者中高表达HBeAg 刺激 RAW264.7 巨噬细胞 24h 后 miR-155、miR-212-3p、miR-132、miR-21等表达明显升高,以miR-155、miR-212-3p升高最为显著。并且miR-212-3p升高与HBeAg呈浓度(P<0.05或P<0.01)及时间(P<0.05)依赖性。与无刺激组相比,miR-212-3p在人THP-1(P<0.05)和U937(P<0.001)细胞系中表达也明显升高。与无刺激组相比,HBeAg刺激组的人外周血单核细胞中miR-212-3p表达明显升高(P<0.001)。为了进一步了解miR-212-3p的临床意义,我们收集了 20例慢性乙型肝炎患者外周血,结果显示,与正常人外周血单核细胞中的表达相比,慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞中miR-212-3p表达明显升高(P<0.001),并且miR-212-3p的表达水平与患者外周血中HBeAg水平呈正相关。3.miR-212-3p抑制HBeAg诱导的巨噬细胞炎症因子的产生在巨噬细胞中分别转染了miR-212-3p mimics、miR-212-3p inhibitor 或者阴性对照物NC。研究发现,转染miR-212-3p mimics上调miR-212-3p的表达可以显著降低HBeAg诱导的巨噬细胞IL-6和TNF-α的表达及分泌(P<0.05或P<0.01)。而转染miR-212-3p inhibi tor敲低miR-212-3p的表达可以明显增加HBeAg诱导的巨噬细胞IL-6和TNF-α的表达及分泌(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。这提示miR-212-3p在HBeAg诱导的巨噬细胞中发挥抑制IL-6和TNF-α的表达及分泌的功能。4.ERK/CREB信号通路促进miR-212-3p的表达Western实验结果提示MAPK通路中的关键分子ERK、JNK和P38的磷酸化形式在HBeAg刺激后明显升高并且于刺激30min时达到高峰后逐渐降低。qRT-PCR及ELISA结果显示HBeAg所诱导的巨噬细胞炎症因子IL-6和TNF-α的表达及分泌均分别被ERK、JNK、P38的抑制剂明显抑制。qRT-PCR结果示ERK抑制剂能够明显抑制HBeAg诱导巨噬细胞中miR-212-3p的高表达。Western实验结果提示CREB在HBeAg刺激后被激活并且受ERK和P38的调控。qRT-PCR及ChIP结果提示HBeAg所诱导的miR-212-3p表达升高可以被CREB抑制剂所抑制并H CREB与miR-212-3p的启动子区域发生结合的序列在HBeAg刺激组明显高于非刺激组。5.miR-212-3p通过作用于MAPK1分子来抑制HBeAg诱导的巨噬细胞炎症因子的产生PITA、miRmap、PicTar、miRanda、TargetScan 等五个数据库软件均预测 MAPK1为miR-212-3p可能的靶基因,本研究通过western blot、qRT-PCR及ELISA实验验证上述假说。Western实验结果提示在RAW264.7巨噬细胞中过表达miR-212-3p可以显著抑制磷酸化及非磷酸化MAPK1的表达,而下调miR-212-3p可以明显促进磷酸化及非磷酸化MAPK1的表达。通过qRT-PCR及ELISA实验可见MAPK1抑制剂(PD98059)可以显著逆转巨噬细胞在转染miR-212-3p inhibitor后受HBeAg刺激所引起的细胞炎症因子IL-6和TNF-α的表达和分泌增加。综上,miR-212-3p通过靶点MAPK1从而抑制HBeAg激活的巨噬细胞炎症因子的产生。结论:1.HBeAg是诱导巨噬细胞活化和炎症因子释放的主要HBV相关抗原类物质,HBeAg可以刺激巨噬细胞中miR-212-3p表达明显升高,miR-212-3p可以抑制HBeAg诱导巨噬细胞炎症因子的产生。2.在巨噬细胞中,HBeAg可以激活MAPK通路,MAPK通路调节了巨噬细胞的激活。在乙肝病毒诱导的巨噬细胞活化过程中,ERK/CREB信号通路促进miR-212-3p的表达,miR-212-3p通过调控靶基因MAPK1来抑制HBeAg诱导的巨噬细胞炎症因子的产生。上述发现为探讨乙型肝炎治疗方法提供了新的理论依据。