酒精性肝病（alcoholic liver disease，ALD）是由于长期大量饮酒导致的肝脏疾病。近年来，由于酒精消费的飞跃发展，ALD已成为全球性的公共卫生问题[1]。ALD初期通常表现为脂肪肝，进而可发展成酒精性肝炎、肝纤维化和肝硬化。目前认为[2]，酒精性肝纤维化（alcoholic liver fibrosis）是ALD发展过程中的转折点，如能去除不利因素，可以逆转上述相关病理改变。因此，对其发病机制及治疗靶点的研究一直是学术界关注的焦点。在酒精性肝纤维化发生过程中，乙醇可通过代谢毒性产物乙醛等多种因素激活肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）。活化的HSC是肝纤维化过程中细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的主要来源，也是各种因素所致肝纤维化发生的中心环节^[3]。尽管HSC在肝纤维化发病中的作用受到了广泛关注，有关细胞因子在HSC内转导的通路也被广泛研究，但由于乙醇致肝纤维化过程极为复杂，影响因素很多，迄今为止，对如何合理抑制HSC活化，逆转酒精性肝纤维化的发展尚无良策。近年来，腺苷A_2A受体由于其复杂的生物学作用以及在多种疾病中的重要调节功能已受到越来越多的关注。Chan^[4]等2006年一项令人振奋的研究表明，HSC上的腺苷A_2A受体活化在肝纤维化的发病机制中扮演着重要的角色，有希望成为预防和治疗肝纤维化的一个新颖的靶点。该项研究发现经乙醇诱导后释放的大量腺苷通过激活HSC腺苷A_2A受体，促进大鼠和人HSC胶原的合成。Hashmi和Sohail^[5-6]的研究也证实了腺苷通过激活A_2A受体在HSC活化致肝纤维化中的作用。Che^[7]等2007年也报道，腺苷A_2A受体通过其耦联的Gs蛋白上调cAMP-PKA信号途径，再分别经由其下游信号通路PKA-Src-ERK1/2MAPK和p38MAPK诱导LX-2人肝星形细胞株I型胶原和III型胶原的生成。咖啡因（caffeine）是世界上消费最广泛的日常饮食成分及精神类药物之一，其基本化学结构含有甲基黄嘌呤类活性成分，在体内主要通过拮抗腺苷A_2A受体和A1受体发挥其主要药理作用^[8-10]。Caffeine与健康的关系一直为科学家所关注，在传统的观念里，经常饮用含caffeine饮料似乎对身体无益[11-12]。但近年来[13-16]，越来越多有趣而又充满争论的流行病学研究被陆续地报道，这就是饮用含caffeine饮料可以显著减少酗酒人群罹患慢性肝病的的机率，包括罹患酒精性肝纤维化的风险。本课题组前期研究表明caffeine通过抑制炎症反应及氧化应激对小鼠酒精性肝损伤具有一定的保护作用，其机制与其抗脂质过氧化、抑制炎性细胞因子以及减少肝组织生脂基因表达有关^[17]。同时研究发现caffeine对乙醛刺激的HSC-T6增殖具有抑制作用，并能够促进其凋亡，其作用机制可能与其上调TRAIL受体DR₄、DR₅的表达有关^[18]。目前，体外培养HSC常作为肝纤维化研究的重要手段，并已建立若干HSC系代替原代HSC作为研究的靶细胞。HSC-T6细胞系即是由大鼠HSC经过SV40病毒转染后形成的永生细胞系，具有无限传代的特性，是肝纤维化研究的良好模型[19-20]。因此本研究采用乙醛干预HSC-T6细胞系，建立离体的大鼠酒精性肝纤维化HSC模型，探讨饮料水平caffeine如何通过腺苷A_2A受体介导的cAMP–PKA–src-erk1/2-p38MAPK信号通路调控乙醛诱导的HSC-T6增殖活化。主要内容概括如下：1.不同浓度caffeine及腺苷受体调节剂作用不同时间对乙醛诱导的HSC-T6增殖的影响分别以caffeine（0.5，1，2，4，8mM），腺苷A_2A受体拮抗剂ZM241385（1，10，100，1000，10000nM），腺苷A_2A受体激动剂CGS21680（1，10，100，1000，10000nM）与HSC-T6共同培养，1h后加入终浓度200uM的乙醛刺激（每12h补充1次），分别继续培养24h，48h，72h后采用四甲基偶氮唑蓝[3-（4,5-dimethylthiazol-2-thiazolyl）-25-,MTT]法分别检测caffeine，ZM241385，CGS21680对HSC-T6增殖的影响。结果显示，caffeine（0.5，1，2，4，8mM）作用24h的抑制率分别是3.56%，7.52%，18.02，25.15%，35.25%；作用48h的抑制率分别是12.05%，22.29%，51.01%，64.65%，67.36%；作用72h抑制率分别是13.68%，16.27%，37.51%，54.51%，85.70%。其中以caffeine（4mM）作用48h的抑制作用最为明显。ZM241385（1，10，100，1000，10000nM）作用24h的抑制率分别是10.25%，10.85%，12.85%，30.88%，23.87%；作用48h的抑制率分别是13.58%，14.81%，16.41%，40.98%，29.51%；其中以ZM241385（1uM）作用48h的抑制作用最为明显。CGS21680（1，10，100，1000，10000nM）作用24h的抑制率分别是-6.79%，-7.89%，-25.88%，-34.7%，-16.1%；作用48h的抑制率分别是-14.33%，-16.33%，-29.12%，-42.34%，-19.1%；其中以CGS21680（1uM）作用48h的增殖作用最为明显。结果表明caffeine及ZM241385对乙醛诱导的HSC-T6增殖具有明显抑制作用，CGS21680能进一步促进HSC-T6增殖，且表现出一定的浓度和时间依赖性。2. Caffeine经腺苷A_2A受体抑制乙醛诱导的HSC-T6增殖活化的作用在上述研究基础上，实验设正常组（常规培养），模型组，咖啡因及腺苷受体（adenosine Receptor，AR）调节剂干预组，分别给予caffeine（4mM），ZM241385（1uM），CGS21680（1uM），caffeine+CGS21680，ZM241385+CGS21680与HSC-T6共同培养，1h后加入终浓度200uM的乙醛刺激（每12h补充1次），继续培养48h。采用荧光定量PCR（Real-time PCR）法检测腺苷A_2A受体mRNA表达水平；免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）的含量；逆转录PCR（reversetranscriptase polymerase chain reaction， RT-PCR）法检测I型前胶原氨端肽（Procollagen I N-terminal peptide，P I NP），III型前胶原氨端（Procollagen III，N-terminal peptide，P III NP），转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1），结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）mRNA的表达；Western blot法检测CTGF蛋白的表达。结果显示，模型组经200uM乙醛作用48h后，α-SMA，CTGF蛋白及腺苷A_2A受体，Procollagen I，ProcollagenIII，TGF-β1mRNA的表达均明显增强；与模型组比较，caffeine及ZM241385均显著降低HSC-T6中α-SMA，CTGF蛋白及腺苷A_2A受体，Procollagen I，Procollagen III，TGF-β1mRNA的表达，CGS21680则具有进一步的促进作用。而与单独用药组比较，caffeine+CGS21680及ZM241385+CGS21680联合用药组上述作用明显逆转。结果表明，caffeine能够显著抑制乙醛诱导的HSC-T6活化，以及显著抑制HSC-T6中腺苷A_2A受体，Procollagen I，Procollagen III，TGF-β1，CTGF的表达水平。提示，其机制可能与阻断腺苷A_2A受体介导的信号通路有关。3.腺苷A_2A受体介导的cAMP/PKA/Src/ERK1/2/p38MAPK信号转导通路在caffeine抑制乙醛诱导的HSC-T6增殖活化中的作用实验分组如上述，采用放射免疫法检测环磷酸腺苷（cAMP）含量；RT-PCR法检测蛋白激酶A（PKA）mRNA的表达；Western blot法检测P-Src，P-ERK1/2，P-p38蛋白的表达。结果显示，200uM乙醛作用48h明显增强HSC-T6中cAMP，PKA，P-Src，P-ERK1/2，P-p38的表达；与模型组比较，caffeine及ZM241385均显著降低HSC-T6中cAMP，PKA，P-Src，P-ERK1/2，P-p38的表达，CGS21680则具有进一步的促进作用。而与单独用药组比较，caffeine+CGS21680及ZM241385+CGS21680联合用药组述作用明显逆转。结果表明腺苷A_2A受体介导的cAMP/PKA/Src/ERK1/2/p38MAPK信号转导通路可能参与了caffeine抑制乙醛诱导的HSC-T6增殖活化的作用。在此基础上，采用caffeine（4mM），PKA抑制剂H89+caffeine（20μM+4mM），Src抑制剂PP2+caffeine（20μM+4mM）， ERK1/2抑制剂U0126+caffeine（20μM+4mM），P-p38抑制剂SB202190+caffeine（20μM+4mM）与HSC-T6共同培养，1h后加入终浓度200uM的乙醛刺激（每12h补充1次），继续培养48h；同时设正常组和200uM乙醛干预模型组。采用RT-PCR法检测Procollagen I，Procollagen III，TGF-β1，CTGF mRNA的表达。结果显示，与caffeine组比较，H89+caffeine，PP2+caffeine，U0126+caffeine均显著抑制Procollagen I，TGF-β1，CTGF的表达，但对Procollagen III无明显抑制作用；SB202190+caffeine显著抑制Procollagen III，TGF-β1，CTGF的表达，但对Procollagen I无明显抑制作用。提示，caffeine可通过抑制cAMP-PKA-Src-ERK1/2/p38MAPK通路下调TGF-β1，CTGF的表达。其可能分别经由cAMP/PKA/Src/ERK1/2通路和p38MAPK通路抑制Procollagen I和Procollagen III的合成。进一步采用Western blot法检测P-Src，P-ERK1/2，P-p38蛋白的表达。结果显示，与caffeine组比较，H89+caffeine，PP2+caffeine能显著抑制P-Src表达，而U0126+caffeine，SB202190+caffeine对P-Src表达无明显影响；H89+caffeine，PP2+caffeine，U0126+caffeine，显著抑制P-ERK1/2表达，而SB202190+caffeine对P-ERK1/2表达无明显影响；SB202190+caffeine能显著抑制P-p38表达，而H89+caffeine，PP2+caffeine，U0126+caffeine对P-p38表达无明显影响。提示caffeine可能分别经由cAMP/PKA/Src/ERK1/2通路和p38MAPK通路抑制乙醛诱导HSC-T6的增殖活化，且PKA，Src，ERK1/2之间可能存在信号转导通路的上下游关系。