异黄酮(isoflavone)是高等植物苯丙烷类次生代谢产物中的一种,集中分布在豆科蝶型花亚科的一些物种中。大豆及各种豆制品是日常生产和生活中最常见的异黄酮来源。研究表明,大豆中的异黄酮类物质能够降低多种疾病的发生,如乳腺癌,膀胱癌,心血管疾病,骨质疏松症及妇女更年期综合症等。大豆异黄酮不仅是植物保护素,而且是豆科植物与固氮菌之间的信号分子,在植物体与微生物互作过程中起着重要的作用。因此,在豆科和非豆科作物中进行异黄酮遗传改良不仅可以增加作物的营养价值,还可以增强植物的抗逆性,具有重要的营养学和农艺学意义。异黄酮是由苯丙烷类代谢途径的一个分支所合成的。前人研究表明,异黄酮合成途径中的异黄酮合酶(isoflavone synthase, IFS)和黄烷酮3-羟化酶(flavanone 3β-hydroxylase, F3H)基因在异黄酮合成过程中起着关键但是却对立的作用。IFS催化所有的异黄酮类物质生成的第一步,而F3H是IFS的一个最重要的底物竞争酶,它与IFS竞争共同的底物以生成黄酮类物质。如何调控异黄酮和黄酮生物合成过程中底物的分流成为作物异黄酮代谢工程的瓶颈。由于基因序列变异可以稳定遗传,并能影响生物的发育及其对环境的反应,尤其是等位基因差异的影响更为巨大,因此我们推测IFS和F3H这两类关键酶的基因中的序列等位变异可能对种子异黄酮的含量产生重大的影响。由于大豆异黄酮与抗逆性密切相关,所以我们猜测IFS和F3H这两类关键酶的基因中的序列变异可能间接影响大豆抗逆性。因此,本研究主要集中于IFS和F3H这两类基因的序列等位变异与异黄酮含量和大豆抗逆性之间的相关性。单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms, SNPs),是指基因组DNA序列中的单个碱基对的变化或小片段的插入/缺失(insert/deletion, Indel),在基因组中分布广泛,稳定遗传,是一种新型的分子标记。SNPs可以引起表型性状的差异。为了找到IFS和F3H基因与大豆种子异黄酮含量及大豆抗逆性相关的causative SNPs,本研究采用了关联分析(Association analysis)的方法。关联分析以自然种质群体为研究对象,能够把目标表型性状同基因的多态性结合起来进行分析,可以直接鉴定出与表型变异密切相关的具有特定功能的等位基因位点,是一种有效的剖析复杂数量性状的方法。在进行关联分析前,我们对于IFS和F3H的基因的多态性水平和模式进行了研究,以了解它们是否适合作为关联分析的候选基因。我们从33份大豆材料中克隆了IFS1,IFS2和F3H基因并进行了测序。这33份材料包括17份栽培豆(Glycine max)和16份野生豆(Glycine Soja),这些材料不仅具有广泛的地理来源(19-49°N,106-131°E),覆盖了中国六个大豆生态区划,而且材料间的异黄酮含量差异显著。对于这33份材料,我们首先进行了遗传多样性分析。用55对覆盖大豆全基因组的非连锁SSR标记对所选的33份材料进行基因分型后发现,这33份材料具有很高的遗传多样性(遗传多样性指数H=0.87),高于文自翔等用同样的55对SSR引物在589份大豆材料中发现的遗传多样性(H=0.82),而且我们所发现的等位基因数目占589份大豆材料中发现的等位基因数目的59%,考虑到材料数目之间的巨大差异(仅占5.6%),我们认为本研究中所选的群体具有较高的遗传多样性,可以用于初步的关联分析。利用小样本进行初步的关联分析不仅能降低研究成本,还可以更快地为在更大群体中进行进一步的验证关联分析提供有效信息。在对样本分析的基础上,我们对这33份材料的IFS1, IFS2和F3H基因进行了SNPs,连锁不平衡(Linkage disequilibrium, LD)分析以及DNA水平自然选择作用的检测。结果表明,在本研究的三个基因中发现的核苷酸多态性(π)在编码区为0.00159-0.00822,非编码区为0.00362-0.00856,远远高于前人所报道的大豆基因组的平均核苷酸多态性水平。DNA水平自然选择作用的检测结果表明,IFS1和IFS2基因在进化过程中经历了净化选择的作用(purifying selection),而F3H基因则并未偏离中性进化假设。这说明IFS基因与F3H基因在进化过程中经历了不同的选择压力,不同的选择过程将会产生特有的序列多态性,而净化选择可以去除群体内的有害突变。我们发现,F3H基因的核苷酸多态性(π)要比IFS1和IFS2基因的都高。F3H基因编码区的π值为0.00815-0.00841,非编码区为0.00503-0.00748；而IFS1基因编码区的π值为0.00208-0.00232,非编码区为0.00769-000856。IFS2基因的则更低(编码区的π值为0.00159-0.00173,非编码区为0.00362-0.00487)。另外,IFS基因在不同物种间也很保守。这说明豆科作物特有的IFS基因比各种植物中广泛存在的F3H基因在进化上要保守得多,表明IFS基因在大豆中具有更重要的作用。与SNPs检测结果相一致,本研究的三个基因在33份材料中的LD延伸距离也非常短,小于1,000 bp。由于这33份材料具有广泛的地理来源,因此可以有更长时间来消除位点间的遗传关联。由此我们认为,本研究的三个基因具有足够的SNPs密度和遗传分辨率,适合用于候选基因关联分析。由于群体结构可能会导致关联分析产生假阳性或假阴性的结果,我们利用上述55对SSR标记对33份材料进行了群体结构分析。分析结果表明,样本的群体结构数目为两个,这与我们材料本身由G. max和G. soja两种不同进化型的材料组成相符。群体结构分析所得的Q矩阵用于后续关联分析。关联分析采用TASSEL软件进行,采用两种运算模型：一般线性模型法(GLM)(不考虑群体结构影响)和Structured Association(SA)测验(考虑群体结构影响),分别进行序列多态性与大豆种子异黄酮含量间的关联分析。结果发现IFS和F3H基因中都有与大豆种子异黄酮含量显著相关的SNPs,说明这三个基因的多态性与大豆种子异黄酮含量都有相关性。为了尽可能地减少群体结构的影响,我们只选择了GLM和SA两种方法同时检测到的与四种性状均显著相关的SNPs位点。对于IFS1基因,在发现的共116个SNPs中有三个位点与四种含量都显著相关,分别为：5’UTR的两个位点(157A/G,696A/G)；第一个外显子的一个位点(1143 T/C),该位点的突变导致氨基酸序列由serine变成了proline。对于IFS2基因,在发现的共104个SNPs中有两个位点与四种含量都显著相关,分别为：第一个外显子的一个位点(1508 C/T,同义)；第二个外显子的一个位点(2353 G/A),该位点的突变导致氨基酸序列由valine变成了methionine。对于F3H基因,在共发现的91个SNPs中有五个位点与四种含量都显著相关,分别为：第一个外显子的一个位点(268A/G同义)；第二个外显子的一个位点(1310A/G),该位点的突变导致氨基酸序列由threonine变成了alanine;第二个内含子的两个位点(1488 T/C,2198 T/C)和第三个外显子的一个位点(2198 C/T),该位点的突变导致氨基酸序列由alanine变成了valine。我们认为这些位点是与大豆种子异黄酮含量最有可能相关的causitive SNPs,可以为功能性分子标记的开发提供有利的信息。为了了解大豆IFS1, IFS2和F3H基因与大豆抗逆性的相关性,我们进行了这三个基因的SNPs与大豆抗生物胁迫(大豆花叶病毒)及非生物胁迫(铝毒,低磷)性状间的关联分析。结果表明,大豆IFS1, IFS2和F3H基因中都存在与大豆对花叶病毒抗性,耐铝毒及耐低磷性状显著相关的SNPs。在IFS1基因中,我们发现与大豆对SMV Sc-3抗性显著相关的SNPs共有14个,其中有12个位点可以组成SNP单倍型(hyplotype): "TCACAACGAOTACA",这个单倍型在材料W HC03和W_HC20这两个表现为高抗的野生材料中被检测到,说明这种SNP单倍型与大豆对Sc-3抗性显著相关,可以开发成抗Sc-3的分子标记。在IFS1基因中发现与大豆对SMV Sc-7抗性显著相关的SNP共2个,其中1,902 bp位点在三个表现为抗花叶病的野生大豆材料中出现,说明IFS1基因1,902 bp的“C/T”变异很可能是一个与Sc-7抗病性显著相关的SNP,可以开发成抗Sc-7的分子标记。在IFS2基因中仅发现一个与大豆对SMV Sc-3抗性显著相关的Indel(1 bp)。在IFS2基因中发现三个与大豆对SMV Sc-7抗性显著相关的SNPs,其中两个为Indel。上述位点均是singleton,所以还需要验证。在F3H基因中发现与大豆对SMV Sc-3抗性显著相关的SNPs共7个,可以组成SNP单倍型："GGACAAG",在发现这个单倍型的14个材料中,有13个材料(93%)表现为抗病,这说明这是一个与Sc-3抗病性显著相关的SNP单倍型,也可以开发成抗Sc-3的分子标记。在F3H基因中发现与Sc-7抗性显著相关的SNP共1个,该位点的“T/A”突变的“T”形式在12份材料中检测到,在这12份材料中有9份(75%)表现为感病,说明该位点可能是一个与大豆对Sc-7感病性状显著相关的SNP,可以开发成鉴定大豆对Sc-7抗性的分子标记。在IFSl与IFS2基因中发现的与耐铝毒性状显著相关的位点均为singleton,所以还需要进一步的验证。在F3H基因中发现一个与耐铝毒性状显著相关的位点,其“G/A”突变的“G”形式在5种野生材料中出现,这5个材料都属于耐铝毒能力比较弱的材料,因此,这个显著位点可以作为开发大豆耐铝毒性状分子标记的候选位点。我们只在两个IFS基因中检测到与耐低磷性状显著相关的位点,在F3H基因中没有发现与大豆耐低磷性状显著相关的位点。在两个IFS基因中检测的显著位点均为singleton,所以还需要进一步验证。综上所述,尽管存在有待改进和完善的因素,但结果仍然具有较高的可靠性和实用性,检测到的多个表型相关的等位基因(SNPs),为开发相应的功能分子标记提供了分子基础,也为深入研究IFS和F3H基因在大豆异黄酮合成与大豆耐逆机制中的作用提供了重要的思路。